KICH, J. D.

PERETTI, M. E.

REBELATTO, R.

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  63 PRESERVAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS INDICADORAS DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA   Maria Eduarda Peretti1, Jalusa Deon Kich2 e Raquel Rebelatto3 1Graduanda em Engenharia de Alimentos pelo Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia, Estagiário da Embrapa Suínos e Aves, Bolsista CNPQ/PIBIC, dudaperetti@hotmail.com 2Pesquisador da Embrapa Suínos e Aves 3Analista da Embrapa Suínos e Aves  Palavras-chave: bactérias indicadoras de resistência antimicrobiana, sistemas de tratamento de dejetos, suinocultura.  INTRODUÇÃO Um dos grandes desafios atuais do setor agropecuário é a redução do uso de antimicrobianos como medida de controle da resistência antimicrobiana (RAM) e sua dispersão no meio ambiente (1). Existem bactérias indicadoras de resistência, que na suinocultura, podem ser isoladas na entrada e saída dos sistemas de manejos de dejetos. A preservação das bactérias indicadoras de RAM é fundamental para o sucesso do isolamento e estudo da resistência e depende da matriz de coleta, do tempo e preservação entre coleta e processamento laboratorial. Diferentemente de trabalhos com finalidade de quantificar bactérias presentes nas amostragens, o objetivo deste estudo é preservar bactérias indicadoras de RAM, independentemente das diferenças entre quantificação inicial e final, a fim de isolar as mesmas e utilizar para estudos fenotípicos e moleculares de resistência. Assim, a fim de avaliar a metodologia a ser utilizada posteriormente para obter bactérias indicadoras de RAM, neste trabalho foi estudada a preservação de Escherichia coli (E.coli) e Enterococcus sp em amostras coletadas em diferentes sistemas de tratamento de dejetos e preservadas em distintas temperaturas, com e sem pré-cultivo em meios com e sem antimicrobianos (ATM).  MATERIAL E MÉTODOS As coletas de dejetos foram realizadas na Embrapa Suínos e Aves, em diferentes sistemas de tratamentos de dejetos de suínos: 1) saída de composteira, 2) entrada da Estação de Tratamento de Dejetos Suínos (ETDS), 3) saída do biodigestor (UASB) da ETDS e 4) ETDS com adição de inóculo de E. coli isolada de fezes de suíno na concentração de 104 UFC/mL (controle positivo). As amostras foram armazenadas e transportadas em frascos estéreis e temperatura ambiente até o laboratório, para pesquisa de E.coli e Enterococcus sp., seguindo metodologia apropriada (2). No dia da coleta (Dia zero - DO), de cada uma das quatro amostras, foi separada uma alíquota e realizada diluição seriada na base 10, plaqueamento de cada diluição, em duplicata, e incubação das placas para contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFC). O restante de cada amostra foi diluído 1:10 em água peptonada (AP) e dividido em 2 partes, sendo que uma foi subdividida em outras 3 alíquotas para conservação em diferentes temperaturas: nitrogênio líquido, refrigeração (entre 4 e 8ºC) e congelamento (-20ºC). A outra parte foi subdividida em duas alíquotas cultivadas com e sem antimicrobianos overnight a 37ºC e, posteriormente, congeladas. Quatorze dias após o armazenamento, as amostras foram retiradas do nitrogênio, congelamento e refrigeração e foram deixadas em temperatura ambiente até equalização das temperaturas. Foi, então, realizada mesma metodologia de diluição seriada, plaqueamento, incubação e contagem UFC/mL.  RESULTADOS E DISCUSSÃO À contagem de E. coli da amostra controle positivo, no DO, foi dois logaritmos superior à do inóculo, o que demonstra que a metodologia funcionou, uma vez que o objetivo é a preservação de bactérias que possam ser indicadoras de RAM, independentemente da quantificação inicial na matriz de coleta.   A utilização de AP com ATB foi testada com intuito de avaliar possível diminuição de outras bactérias e, consequentemente, melhor preservação das bactérias indicadoras de RAM. Porém, a utilização de AP sem o uso de ATB mostrou melhor preservação das bactérias indicadoras de RAM.   Para E. coli (Tabela 1), a amostragem de saída de composteira não possibilitou contagem de bactérias, com exceção do DO. As demais matrizes de coleta e metodologias testadas permitiram contagem variando entre 103 e 1010 UFC/mL, com exceção da amostra de saída de biodigestor preservada a -20ºC e ETDS refrigerada, nas quais não houve crescimento colônias de E.coli.   Para Enterococcus (Tabela 2), todas as matrizes de coleta e metodologias testadas permitiram contagem, variando entre 103 e 1010 UFC/mL, com exceção da amostra de entrada da ETDS e saída de composteira que foram cultivadas em AP com ATB e preservadas a -20ºC, nas quais não houve crescimento colônias de Enterococcus sp.  As contagens mais uniformes entre as diferentes matrizes de coleta, tanto para E. coli quanto para Enterococcus sp. foram obtidas com pré-cultivo em AP sem ATB e congelamento a -20ºC.     64 CONCLUSÕES Para contagem de E. coli e Enterococcus sp., de amostras coletadas de diferentes sistemas de tratamento de dejetos de suínos e conservadas por 14 dias pós coleta, a metodologia ideal foi pré-cultivo em AP sem ATB e congelamento a -20ºC.  REFERÊNCIAS 1. OIE. World Organisation for Animal. OIE Annual report on antimicrobial agents intended for use in animals. Third report, 2018. 2. QUINN, P.J., MARKEY, B.K, CARTER, M.E., DONNELLY, W.J., LEONARD, F.C. In: Microbiologia Veterinária e Doenças Infecciosas. 1 ed., São Paulo: Artmed, 2005, 512p.  Tabela 1. Resultado das contagens de Escherichia coli. Matriz de coleta  das amostras Metodologias de preservação D0 Nitrogênio 4°C -20°C Cultivo AP com ATB  Overnight e -20°C Cultivo AP sem ATB  Overnight e -20°C ETDS - Entrada 2,20E+03 3,94E+04 3,94E+04 6,90E+03 4,30E+05 1,35E+07 Biodigestor - Saída 4,50E+03 6,00E+04 6,00E+04 0,00E+00 8,35E+07 9,05E+07 Composteira - Saída 3,30E+05 ° ° ° ° ° ETDS + Inóculo 1,00E+06 7,10E+04 ° 4,90E+04 1,47E+10 9,00E+06 ° Crescimento de outras colônias.  Tabela 2. Resultado das contagens de Enterococcus. Matriz de coleta  das amostras Metodologias de preservação D0 Nitrogênio 4°C -20°C Cultivo AP com ATB  Overnight e -20°C Cultivo AP sem ATB  Overnight e -20°C ETDS - Entrada 2,80E+05 2,85E+04 0,00E+00 7,85E+04 ° 2,85E+09 Biodigestor - Saída 6,50E+03 1,15E+04 3,05E+04 8,85E+03 1,83E+08 1,00E+08 Composteira - Saída 7,50E+03 2,95E+04 8,35E+04 1,90E+04 ° 4,45E+07 ETDS + Inóculo 2,20E+05 1,73E+05 1,93E+05 2,95E+03 3,32E+10 6,30E+09 ° Crescimento de outras colônias.                          

Preservação de amostras para isolamento de bactérias indicadoras de resistência antimicrobiana.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/1137798/1/final9844.pdf

Preservação de amostras para isolamento de bactérias indicadoras de resistência antimicrobiana.

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