La distrofia muscolare facio-scapolo-omerale (FSHD) è una miopatia genetica unica e complessa la cui patogenesi molecolare è ancora oscura. I topi che sovraesprimono FRG1, un gene situato nel locus FSHD 4q35 che codifica una proteina legante l'RNA, sono l'unico modello animale che sviluppa una distrofia muscolare con caratteristiche della malattia umana. Studiando i profili di espressione dei muscoli scheletrici di topi che sovraesprimono livelli crescenti di FRG1 a 28d (esordio della distrofia) e a 91d (distrofia completa) abbiamo osservato una profonda disregolazione trascrizionale che associa la gravità del fenotipo muscolare al livello di espressione di FRG1. Le analisi di Gene Ontology e Gene Set Enrichement mostrano un'ampia disregolazione dei geni specifici del muscolo, con il mantenimento delle isoforme embrionali e la mancanza di quelle mature. La nostra analisi ha rivelato il mantenimento eterocronico delle isoforme immature delle miosine, nonché l'espressione dell'isoforma embrionale del recettore dell'acetilcolina, della sarcolipina e dell'esochinasi 1. A partire da 14d i topi con sovraespressione di FRG1 presentano una decelerazione della curva di crescita e una ridotta area della sezione trasversale delle fibre muscolari prima della comparsa dei segni distrofici. Inoltre, il sequenziamento dell'RNA condotto a 14d ha rivelato che oltre all'espressione anomala di isoforme embrionali e neonatali legate alla contrazione muscolare, si verificano importanti cambiamenti metabolici che coinvolgono la gluconeogenesi. Inoltre, a partire dall'età di 7d nel muscolo FRG1 osserviamo l'attivazione della risposta allo stress legato all'asse IL6-CCL2-P38-AKT a causa del sovraccarico meccanico causato dall'immaturità muscolare. L'attivazione prolungata del meccanismo di risposta allo stress oltre i 14d determina l'attivazione di p53 e dei suoi effettori Cdkn1a e Gadd45a e l'insorgenza di un fenotipo secretorio associato a senescenza (SASP). Nel tempo, a partire dai 28d abbiamo rilevato una risposta infiammatoria progressiva nel muscolo FRG1 con il coinvolgimento di macrofagi, cellule T e progenitori fibroadipogenici (FAP). È interessante notare che l'analisi del profilo di espressione del muscolo transgenico FRG1 mostra una significativa sovrapposizione con i profili trascrizionali ottenuti nei muscoli di modelli animali e di pazienti affetti da distrofie muscolari e disturbi del motoneurone. Questa analisi ha rivelato un panorama trascrizionale comune che include l'alterazione delle pathway legate alla funzione muscolare, al metabolismo energetico e all'infiammazione. Questa osservazione suggerisce che a livello muscolare, indipendentemente dalla noxa originale, condizioni croniche determinano danni molecolari simili.
Infine, esplorando la funzione molecolare di FRG1 abbiamo scoperto che si lega al lncRNA NEAT1 provocando la sovraespressione di NONO e HEXIM1 nei muscoli transgenici FRG1, tutti componenti dei corpi ribonucleoproteici. I nostri dati suggeriscono che NEAT1, FRG1, HEXIM1 e NONO costituiscono un complesso ribonucleoproteico che ha un ruolo nella risposta allo stress.
Complessivamente i nostri studi suggeriscono il ruolo di FRG1 nella risposta allo stress e dimostrano che la sua sovraespressione cronica causa una compromissione globale della maturazione muscolare, un'alterazione del metabolismo energetico e l'attivazione del percorso di risposta allo stress che porta a senescenza e infiammazione. Tutti questi risultati hanno importanti implicazioni per la salute umana e, in particolare, per i soggetti portatori del difetto molecolare della FSHD che potrebbero essere più sensibili agli stress ambientali, aprendo una nuova prospettiva traslazionale per quanto riguarda i potenziali biomarcatori e le strategie terapeutiche.Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is a unique and complex genetic myopathy whose molecular pathogenesis is still obscure. Mice overexpressing FRG1, a gene located in the FSHD 4q35 locus coding a RNA binding protein, are the unique animal model developing a progressive muscular dystrophy with features of human disease. Investigating the expression profiles of skeletal muscles of mice overexpressing increasing levels of FRG1 at 28 d (dystrophy onset) and at 91 d (full dystrophy), we observed a profound transcriptional deregulation associating the severity of the muscle phenotype with the level of FRG1 expression. Gene Ontology and Gene Set Enrichment Analysis show extensive dysregulation of muscle specific genes, with maintenance of embryonic isoforms and lack of mature ones. Postnatal characterization of transgenic mice confirms the anomalous expression of embryonic/neonatal proteins fundamental for muscle structures, contraction and metabolism, revealing the heterochronic maintenance of immature isoforms of myosin light and heavy chains, as well as the expression of the embryonic isoform of the acetylcholine receptor, sarcolipin and hexokinase 1, and a global delay of muscle maturation. Starting from 14 d FRG1 overexpressing mice present deceleration of growth curve and reduced cross-sectional area of muscle fibers before the appearance of dystrophic signs. Therefore, the RNA sequencing conducted at 14 d revealed that beside the anomalous expression of embryonic and neonatal isoforms related to muscle contraction, major metabolic changes occur with the enhancement of gluconeogenesis and lipolysis. Remarkably, starting at age 7 d in FRG1 muscle we observe the activation of stress signal response pathway linked to IL6-CCL2-P38-AKT axis, due to mechanical overload caused by muscle immaturity. The prolonged activation of the stress response machinery beyond 14 d of age determines the activation of p53 and its downstream effectors Cdkn1a and Gadd45a and the onset of a secretory phenotype associated with senescence (SASP). Through time, from 28 d of age, we detected a progressive inflammatory response in FRG1 muscle with the involvement of macrophages, T-cells and fibroadipogenic progenitors (FAPs). Interestingly, expression profile analysis of FRG1 transgenic muscle shows significant overlap with transcriptional profiles obtained in muscles of animal models and patients affected by muscular dystrophies and motor neuron disorders. This analysis reveals a common transcriptional landscape including the alteration of pathways related to muscle function, energy metabolism and inflammation. This observation suggests that, regardless the original noxa, chronic conditions determine similar molecular damages in muscle.
Remarkably, exploring the molecular function of FRG1 we detected its direct binding with the long non-coding RNA NEAT1, eliciting the overexpression of NONO and HEXIM1 in FRG1 transgenic muscles, all components of ribonucleoprotein bodies. Our data suggest that NEAT1, FRG1, HEXIM1 and NONO constitute a nuclear RNA-associated protein complex that is part of the cell stress response machinery.
Overall our studies highlight the role of FRG1 in muscle response to contractile strain and demonstrate that the chronic overexpression of FRG1 causes a global impairment of muscle maturation, alteration of energy metabolism and activation of stress response pathways leading to senescence and inflammation. All these findings have important implications for human health. In particular, subjects carrying the FSHD molecular defect may be more sensitive to environmental stresses, opening new translational perspectives regarding potential biomarkers and therapeutic strategies for FSHD and other myopathies
