Characterization of a partner switching system regulating c-di-GMP levels in Sinorhizobium meliloti. Implication in the synthesis of a novel exopolysaccharide

Abstract

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 04-02-2016Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 04-08-2017Sinorhizobium meliloti produce un β-D-glucano de enlaces alternos (1→3) (1→4) (ML β-glucano) en respuesta a altos niveles de diguanilato cíclico (di-GMP-c). Dos proteínas, BgsB y BgsA, son las responsables de la síntesis, siendo BgsA la glucano sintasa que sensa dichos niveles de di-GMP-c. La transcripción de los genes bgsBA depende del regulador global ExpR, perteneciente al sistema de quorum sensing Sin/ExpR. Este estudio se centra en la caracterización de un operón que regula la síntesis del ML β-glucano en S. meliloti. Dicho operón fue identificado a raíz de un análisis fenotípico de mutantes afectados en el metabolismo del di-GMP-c. De los seis genes que lo constituyen, SMb20447 codifica para una proteína anotada como diguanilato ciclasa/fosfodiesterasa. Se demostró que esta proteína es activa como diguanilato ciclasa y que induce la síntesis del ML β-glucano. A diferencia de lo observado con los genes bgsBA, la transcripción del operón de estudio no es dependiente de ExpR, formando así un sistema de regulación adicional. Al menos tres de las proteínas codificadas en este operón conforman un sistema de “partner switching” semejante al que existe en Bacillus subtilis, el cual se encarga de regular respuestas frente a stress a través de los factores de transcripción σB y σF. Mediante un abordaje genético, hemos determinado que las proteínas SMb20450 y SMb20451, que presentan dominios característicos de fosfatasas y serin-quinasas respectivamente, modulan la actividad represora de SMb20452, una proteína con dominio STAS presente en factores anti-anti-sigma y en transportadores de sulfato. Este sistema regula la actividad diguanilato ciclasa de SMb20447 a nivel posttranscripcional, a través de una posible interacción con SMb20452. El operón parece estar bien conservado en especies de la familia de las Rizobiáceas que también presentan los genes bgsBA, por lo que el sistema de regulación del ML β-glucano en estas bacterias podría ser parecido. En cuanto a su papel biológico, el ML β-glucano es necesario durante el proceso de adhesión a las raíces de alfalfa. Sin embargo, su producción de forma constitutiva no supone ninguna ventaja en relación a este tipo de adhesión. El ML β-glucano no participa en la interacción simbiótica con la planta, ya que no sustituye las funciones desempeñadas por los exopolisacáridos succinoglicano (EPS I) o galactoglucano (EPS II). Un análisis transcriptómico global mostró que el operón SMb20447-SMb20452 podría regular otros procesos como la producción de EPS II y sideróforos, adaptación a condiciones microaeróbicas, o transporte de cationes.Sinorhizobium meliloti synthesizes a mixed-linked (1→3) (1→4)-β-D-glucan (ML β-glucan) in response to high levels of cyclic diguanylate (c-di-GMP). Two proteins, BgsA and BgsB, are required for the synthesis, being BgsA the glucan synthase sensing c-di-GMP levels. The transcription of the bgsBA operon is dependent on the global regulator ExpR, which also forms part of the quorum sensing system Sin/ExpR. This study is focused on the characterization of an operon regulating the synthesis of the ML-β glucan in S. meliloti. The operon was identified as a consequence of a screening of mutants affected in c-di-GMP metabolism. Among the six genes that constitute the operon, SMb20447 codes for a protein annotated as a diguanylate cyclase/phosphodiesterase. We demonstrated this protein is active as a diguanylate cyclase, and triggers the synthesis of the ML β-glucan. Unlike the bgsBA genes, the transcription of the operon is not dependent on ExpR, thus forming and additional regulatory system. At least three of the gene products in the operon seem to form a partner switching system that resembles the one regulating Bacillus subtilis general stress response through sigma factors σB and σF. Using a genetic approach we determined that the proteins SMb20450 and SMb20451, which present putative phosphatase and kinase effector domains respectively, modulate the repressor activity of SMb20452, a STAS (sulphate transporter and anti-sigma antagonist) domain protein. The system regulates the diguanylate cyclase activity of SMb20447 at the posttranscriptional level, probably through a direct interaction with SMb20452. The operon is well conserved in bacteria from the Rhizobiaceae family that present the bgsBA genes, indicating a similar role in these putative ML β-glucan producers. Regarding its biological role, the ML β-glucan proved to be very important for the attachment to alfalfa roots. However, its constitutive expression does not provide any advantage in relation to such attachment. This novel EPS did not present a symbiotic function, since it could not substitute either succynoglican (EPS I) nor galactoglucan (EPS II). Global transcriptomic analysis revealed that the SMb20447-SMb20452 operon might regulate other processes like galactoglucan (EPS II) and siderophore production, adaptation to microaerobic environments, or cation transpor