【緒言】ラット肝rMsにPLaseCを作用させると,酵素反応の直接生成物DGの存在量がPL分解量から計算される値にくらべて少量であり,また, PLase C処理rMsをsucrose 濃度勾配遠心すると低密度画分のDG含有率が高く,形態的には膨潤vesicleの密度の高いことを報告した.この報告では,このようなDG存在量とPL分解量との差の原因を解明するための実験の結果及びPLase C処理rMsをさらに細かく濃度勾配遠心してDGの分布及び脂肪酸組成を分析した結果を報告する

大畑  元造

森  広次

磯田  幸博

須藤  誠一

首藤  博敏

論文(Article)【緒言】ラット肝rMsにPLaseCを作用させると,酵素反応の直接生成物DGの存在量がPL分解量から計算される値にくらべて少量であり,また, PLase C処理rMsをsucrose 濃度勾配遠心すると低密度画分のDG含有率が高く,形態的には膨潤vesicleの密度の高いことを報告した.この報告では,このようなDG存在量とPL分解量との差の原因を解明するための実験の結果及びPLase C処理rMsをさらに細かく濃度勾配遠心してDGの分布及び脂肪酸組成を分析した結果を報告する.departmental bulletin pape

須藤,  誠一

磯田,  幸博

首藤,  博敏

森,  広次

大畑,  元造

Yamagata University Academic Repository

山形大学紀要(農学)第10巻第1号:99-104.昭和61年1月BulJ. Yamagata Univ.， Agr. Sci.， 10(1) : 99-104. Jan. 1986 Phospholipase類による生体膜の分解に関する研究(第2報)ラット肝ミクロソ{ムの PhospholipaseC処理中に生成するジグリセリドの分解須藤誠一・磯田幸博・首藤博敏森 広次・大畑元造・佐藤博信(山形大学農学部生物化学研究室)(昭和60年9月2日受理)Studies on the Degradation of Biomembranes by Phospholipases. 2. Degradation of Diglycerides Formed during Phospholipase c-Treatment of Rat Liver Microsomes Seiichi SUTO， Yukihiro IsoDA， HirotoshiSHUTO， Koji MORI， Motozo OHATA and Hironobu SATO Laboratory of Biological Chemistry， Faculty of Agricu1ture， Yamagata University， Tsuruoka 997， Japan (Received September 2， 1985) 緒言ラット肝 rMsに PLaseCを作用させると，酵素反応の直接生成物 DGの存在量がPL分解量から計算される値にくらべて少量で、あり，また， PLase C処理 rMsをsucrose 濃度勾配遠心すると低密度画分の DG含有率が高く，形態的には膨j閏vesicleの密度の高いことを報告した1)この報告では，このような DG存在量と PL分解量との差の原因を解明するための実験の結果及びPLase C処理rMsをさらに細かく濃度勾配遠心して DGの分布及び脂肪酸組成を分析した結果を報告する.実験材料及び方法実験に使用したラット，肝 Ms及び rMsの調製方法，PLase C処理方法，蛋白質， RNA， PL-Pの定量方法は前報の通りであるベ略号， DG : diglyceride， FFA: free (unesterified) fatty acid， MeOH: methanol， MG: monogly. ceride， Ms: microsome， NL : neutral lipid， PL: phospholipid， PLase phospholipase， PMSF: phenylmethanesulfonyl fiuoride， rMs rough microsome， sMs smooth microsomes， TG : triglyceride 9 1. sMsの調製Msの 0.25M sucrose suspensionを前報と同じく，下から 2.0M， 1.3 M sucroseからなる不連続濃度勾配上に重層して遠心した.1.3 M sucrose ]雪上の界面の浮遊物を採取して 0.25M sucroseで希釈し， 77，500x g， 1時間遠心して sMsを沈澱させた.2. Glycerideの分画定量Bligh-Dyer法2)で脂質を抽出し，水溶性成分を除去したあと CHC13層をN2気流下に減圧乾潤した.それを少量の CHC13に溶解して，CHC13で洗浄したケイ酸カラムに注加し，CHC13で溶出する NLとMeOHで溶出するPLとに分画した幻.NL，画分は N2気流下に減圧乾I回し，ケイ酸カラムを n-hexane-ether混合溶媒系で溶出するHirsch & Ahrenの方法りを若干改良したタロマトグラフィ}によって， TG (ether8 %で溶出する画分)， DG (同35%)，MG(同100%)に分画，各画分のエステル結合をヒドロキサム酸法5)で定量した.FFAの定量は抽出した脂質の NL底分についてItaya-Ui法6)によっておこなった.3. Lipase 活性の測定基質に o1iveoil宏用いた. 構成脂肪酸はオレイン酸100 山形大学紀要(燥学)第10巻第1号79%，パノレミチン酸12%，リノー ノレ酸9%であった.Olive oil 200 mgを50mgのアラビアゴムと 500mgの牛血清アルブミンを溶解した 5mlの 0.1M Tris bu妊er(pH9)と容器中で N2ガスと置換してから超音波処理して反応用基質 emulsionを調製した.反応液は全容 1ml中， Msを5mgprot巴in，olive oil emulsionを 0.3ml，sucroseを 250μmol合む組成とし， 30'Cに60分 incu.bateした.反応終了時 CHCI3-M巴OH混液を加えて直ちに脂質を抽出し，遊離した脂肪酸をItaya-Ui法6)で定量した.Dioleinのemulsionも同様に調製して使用した.4. PLase C処理rMsの細分画前報。では1.3M sucrose上に処理 rMsの 0.25Msucrose suspensionを重層して縮分闘をおこなったが，本報ではー歩すすめて1.3M の下に1.5M層をおいて3層よりなる不連続濃度勾配遠心をおこない，前報のP画分を2分する実験をおこなった.処理rMsの 0.25Msucrose suspension 4 mlを，下層から1.5M sucrose 1.5 ml， 1.3 M sucros巴4.5mlの不連続濃度勾配上に重層し， 264，500 x g， 2時間遠心した.1.3M層上及び1.5M層上の界面の浮遊物をそれぞれ採取し， 0.25 M sucrose で希釈して 77，500x g， 11寺間遠心Lて沈澱させたものを， F1.3回分及び F1.5画分とし，また，遠心管底に沈澱する画分を P1.5として分析に供した.5.脂肪酸組成の分析Bligh-Dyer法2)で脂質を抽出し， "2. Glycerideの分割定量"の項にしたがって NLと PLに分画した. NL 画分をシリカゲノレ薄層クロマトグラフィーり(溶媒系 ItIl-hexan巴-ether-問。酸， 50 : 50 : 1)によって DGとFFAに分別し，それぞれのスポットをかきとり， CHCI3-MeOH混液で抽出した.分離した PL，DG， FFAそれぞれを 5%HCl含有 MeOH中で脂肪酸をメチル化し，n-hexaneで抽出した.以上の操作はすべて N2ガス位換下におこなった.脂肪酸メチルは Unisole 3000の径2mm，長さ 3mのカラムを用いるガスタロマトグラフィーで分析した.Carrier gasは N2，170"(から 3'C/分の速度で210'Cまで昇温し，以後恒温にする昇温法を採用した叫実験結果1. PLase C処理により生成した DGの分解前報1)で 1・Msを PLaseCで処理すると，この酵素の反応生成物である DGの存在量がPLの分解量から求められる量にくらべていちじるしく少ないことを報告したが，今回はまずこの点の確認をおこなった.前報と同じ条件 (19'C，30分)で rMsとsMsを PLaseC処理し，PL-Pの減少量と glycerideのエステル結合の量及び)脂肪酸の生成量を測定した結果を，構成する脂肪磁のmicro当量に換算して Table1に示す.rMs及び sMsとも PLは約60%分解され， DGは PL分解量の約70%Table 1. Phospholipid Degradation by Phospholipase C and the Formation of Glycerides and Fatty Acids in Rat Liver Microsomes Phospholipase C Treatment Phospholipid Degraded Fatty Acid Formed Glycerides Formed Diglycerides Monoglycerides Rough Microsomes Smooth Micr目osomes+ Diff. + Diff. μmol of fatty acids 3.62 9.66 -6.04 6.94 16.90 -9.96 1.71 0.49 1.22 2.54 0.72 1.82 4.18 7.04 0.09 0.35 Micromoles of each component are indicated in terms of micro-equivalents of the constituting fatty acids. 100 2. Ms内在 TGlipaseによ'.5DGの分解ラット!汗 Msには長鎖脂肪酸のグりセリドを水解するTG 1ipaseが存在し， PMSFで阻害される0) また，肝臓を heparinで滋流すると， TG lipase は血清中に溶出される IQ). Table 3に 10→M PMSF存在下に PLaseC処理し，遠心回収した sMs中の FFA生成量を測定した結果を示す.PLase C未処理の場合は PMSFはFFA生成を完全に阻害し，処理 sMsでは PLaseCによって培強された活性(1.47μ11101)を未処理sMs以下の活性(0.18μ11101)にまで低下させた.肝臓を海流するかわりに，分離した sMsを 0.25Msllcrose溶液中で sMs蛋白 質 1mg当り 8lInitのheparinと19'C，30分 incubateし， 54;000xg， 1時間遠心して peJletと上清に分画した.回収した heparin処理 sMsはさらに PLaseC処理してIipase活性の変化を測定した (Table4A).また上清によゐ oliveoilとdioleinの分解を Table4Bに示す.Heparin処理 sMs(1.46μmol)は未処理 sMs(1.69μ11101)より Iipase活性があった.sMsを PLaseCで1WC，30分処理したのち， 54，OOOx g， 1時間遠心して回収した処理sMsのIipase活性は，Fig.1に示すように無処理の場合にくらべて精力日した.同様にして chymotrypsin処理した結果と蛋白質 1mg当り 0.2unitの PLaseCを作用させて遠心回収したsMsに chymotrypsinを作用させた結果を Fig.2に示す.Chymotrypsinのみの処理では低波度(50μg)で若干Iipase活性が増加したが，より濃度を治すと阻害されるようになった.PLaseCで前処理した sMsの場合，lipase活性は強く阻害され， chymotrypsin単独処理の場合と間程度に低下した.これらのことは， PLaseCの作用でIipas巴の活性の発現が促進され，かつ proteaseで分解されやすい状態になることを示すと考えられる.また，Table2 ~こ示すように ， 添加した diolein は明らかに Fig.1に示す oliv巴oil分解と同程度に分解された.101 μmol/60 n山 ./mgmicl・ωomalprotein Table 2. Degradation of Diolein by the Rat Liver Microsomal Lipase D刷 nAddition I Oleic Acid Formed 2.59 1.64 PLaseによる生体践の分解 (2)一一須藤・磯田・首藤 ・森 ・大畑・ 佐藤+ 101 Smooth 存在し， FFA生成量は約20%であった.DG， MG， FFA の総脂肪酸当量はPL-P減少当量の90%以上の回収率で同判Q) . E 晶H '" 目。" 。h 0 .同国且. c;> 2.0 二gE首>- 1.0 . " 、4. 。目立Unit /田gsmooth miorosomal protein Phospho11pase C Conoentrat1on Fig. 1. Effect of Phospholipase C on the Sl1100th Microsomal Lipase Activity. o 1.0 2，0 Uniも/mg smooth ml0r080mlll proteln Chyrno色rypolnConoentration Fig. 2. Effect of Chymotrypsin on the Microsomal Lipase Activity. 一ー一.一一一;treated with chymotrypsin only 一一圃一一;preincubated with phospholipase C then treated with chYl110trypsin 0，4 0，2 。同. 0 6 。h 向宮田。ーのe 2.0 0 ・~a a .， 。伺. E ¥1.0 噂・4s 〉、φ・s・64. 自立?? ???????。〈? ? ?????? ????????????????102 山形大学紀要(農学)第10巻第1号Table 3. E狂的tof Phenylmethanesulfonyl Fluoride on the Fatty Acid Liberation in the Microsomes Treated with Phospholipase C at 19'C for 30 Min. Phospholipase C Treatment I 十Phenylmethanesulfonyl I十Fluorid巴Fatty acid liberated μmol 0.16 0 1.47 0.18 Tabl巴 4.Effects of Heparin and Phospholipase C on the Microsomal Lipase Activity A) Lipase Activity of th巴Heparin-treatedPellets He句明仰叫p凹附阿凶ar副仙は巾i訂川I + Phospholipase C + Treatment μmol fatty acids/mg microsomal prot巴in1.48 1.46 2.44 1.69 B) Lipase Activity of the Heparin Supernatant Substrate Fatty Acid Liberation Olive Oil Diolein μmoljr昭 solubleprotein 0.42 0.17 小さく (Table4A)，かっ Table4Bに示すように上清はdioleinも oliveoilも分解した.また heparin未処理sMsでは PLaseC処理によって lipase活性が増大したが， heparin処理ではこの増大効果がみられない.これらの結果は， heparinはMsから TGlipaseを遊離し，そのために DGの分解が抑制されることを示す.3. PLase C処理rMsの細分画と脂肪酸組成前報1)では PLas巴C処理 rMsを1.3M sucroseをmいた不連続濃度勾配で細分間し，成分の分布を求めたが，今回はもう一段 sucrose濃度層を増加し， 1.3 Mと1.5M層上に浮遊する画分(F1.3及び F1.5)及び遠心待底に沈澱する P1.5画分に分画した.Table 5に示すように，前報の結果と同様蛋白質当り RNA量は，処理1，未処理で大きな差がなく，比重の大きい画分ほど大きい.PL-Pは処理 rMsが減少し，比重の小さい画分ほど小さい値を示した.DG は浮遊画分が大きいが， F 1.3 とF1.5との聞に大きな差はみられなかった.Table6に PLas巴C処理によって分解されずに残存するPL及び比較的大量に生成する DGとFFAの脂肪険組成を示す.全体としては飽和脂肪酸の割合が圧倒的に大きく， PLでは残存部分の不飽和脂肪酸，特にアラキドン般の割合が減少した.飽和脂肪酸を比較すると残存PLにおいてはパルミチγ酸よりステアリン酸の割合が増し，生成した DGとFFAではパルミチン酸の割合が増大した.FFAにおいては， P 1.5に飽和脂肪酸が多く，浮遊画分にアラキドン酸が多い.DGでは浮遊園分でパノレミチン酸の割合がステアリ γ酸より増大した.?察ラット肝 Msに19"Cで30分 PLaseCを作用させると，生成した DGの約20%が分解されて脂肪酸が生成した(Table 1).また， Table2に示すように外部から添加しTable 5. Composition of th巴 SucroseGradi巴ntSubfractions of Phospholipase C-treated Rough Microsomes Subfraction * Diglyc巴ride mgRNA/r暗 ProteinPhospholipid-P μmoljmg rough microsomal protein 0.28 0.103 0.14 0.32 0.058 0.25 0.17 0.058 0.34 0.345 0.12 0.207 0.31 0.168 0.38 +F1.3 十F1.5十P1.5-F1.3 -F1.5 -P1.5 *， + indicates the subfractions of phospholipase C-treated microsomes， and -not treated. F1.3 and F1.5 ar巴 thefloating subfractions at the interface on 1.3 M and 1.5 M sucrose layer， respectively， and P1，5 the pellets at the bottoms of centrifuge tubes. 102 PLaseによる生体践の分解 (2トー 須藤 ・磯田 ・首藤 ・森 ・大畑 ・佐藤 103 Table 6. Faty Acid Compositions of Phospholipid， Diglyceride， and the Free Fatty Acid Fraction of the Subfractions of Phospholipase C-treated Rough Microsomes Lipid I Fatty Acid ¥¥| Subfraction* I Myristic Palmitic Palmitoleic Stearic Oleic Linoleic Arachidonic % of the total fatty acids of each lipid Phospholipid F1.3+ 0.5 30.3 0.9 1.1 27.1 2.0 F1.5+ 0.3 26.8 0.9 0.2 23.4 0.9 P1.5+ 。 33.4 0.8 0.1 28.5 0.6 Diglyceride F1.3+ 4.1 48.4 6.4 F1.5+ 3.2 45.7 2.6 P1.5+ 1.3 38.9 3.1 Free Fatty Acid F1.3+ 0.6 41.2 4.0 F1.5+ 3.4 41.4 4.3 P1.5十 2.9 44.2 1.9 *， These are the same as the legend of Table 5. た dioleinは oliveoilと同様に水解された.PMSF存在下に PLaseC処理をおこなうと， FFAの生成は抑制された(Table3).分離した Msをheparin処理し，それにPLaseCを作用させると， Table 4に示すように 1回の heparin処理だけでJipaseの Msからの遊離がみとめられ，かっ PLaseC処理Msの Jipasev主著るしく減少した.これらの結果は肝 Ms内在の TGJipaseの性質引10)と一致し，この酵素は TGだけでなく DGをも分解することを示す的.DGの分解の程度は incubationの条件によって異なり，HigginsllJによれば脂肪酸生成のない条件設定が可能でトある.Table6に示すように，残存 PL中の飽和脂肪酸の割合が増加することは不飽和脂肪酸を含む PL分子をより多く分解し，他のリピド成分へ変化させることを示す.飽和脂肪酸の増加にみあうような不飽和脂肪酸の顕著な場加を示す数値はみられないが， DG及び FFAではパルミチン酸がステアリン酸より多く含まれる.膜脂質の流動性は構成脂肪酸中の不飽和脂肪酸が多いほど，炭素鎖の短かい脂肪酸の多いほど大きくなる12).PL以外のDGや FFAにパルミチγ酸の多いことは，前報IJで報告した PLaseC処理 Msの13潤をもたらすー要因であ103 54.3 7.6 0.9 5.6 35.0 10.6 8.1 16.2 69.8 1.1 0.4 0.7 34.1 9. 9.2 22.3 52.6 6.3 1.9 4.8 41.6 6.1 7.3 15.9 30.2 9.4 0.5 1.0 32.3 9.9 5.1 1.3 40.2 10.8 3.6 2.1 31.2 11.9 3.3 7.9 34.7 8.6 0.6 7.1 41.3 8.5 1.2 。ると考えられゐ.摘 要1.ラヅト肝ミクロソ ームの phospholipaseC処理中に生成する diglycerideが分解される機作を検索した.2. Diglyc巴rideの存在量は phosphoJipidの分解量から計算される値の約70%，脂肪酸の生成量は約20%であった.添加した dioleinは oliveoilと同程度の強さで分解された.3. ミグロソームのIipase活性は phospholipaseC 処理及び少量の chymotrypsin処理で増加したがphospholipase Cで前処理したミクロソームの lipaseはchymotrypsinによって強く阻害された.4. ミクロソームをセりン酵素の限害剤 phenylme.thanesulfonyl fluoride存在で phospholipaseC処理すると脂肪酸の生成はほぼ完全に阻害された. ミクロソ ームを phospholipaseC処理と同じ条件で1回heparin処理するだけでミクロソームから lipaseの強い遊離がみられ， heparin処理ミクロソームのJipase活性は著るしく低下した.よって， phospholipase C処理中に生成した diglycerideは heparinで遊離する TGlipaseによ104 山形大学紀要(農学)第10巻第l号って分解されると結論した.5. Phospholipase C処理粗商ミクロソームを1.5M 及び 1.3M sllcroseを重層する不連続濃度勾配遠心で細分画し， diglycerideの分布及び phospholipid，digly. ceride，遊離脂肪敵画分の脂肪酸組成を検索した.Digly. cerideは浮遊商分に多く分布したが，浮遊画分相互の聞には大きな差がみられなかった.脂肪酸組成では飽和脂肪酸の割合が大きし残存 phospholipid中では不飽和脂肪散の割合が減少した.遊離脂肪酸では沈澱画分の飽和!J日肪酸の割合が大であった.謝辞ガスクロマトグラフィー実施で御指導いただいた本学習靖産学研究室高橋敏能さん，食品栄養学研究室五十嵐喜治さんに感謝します.引用文献1吟)須藤誠一(1985)山形大学紀要(決学)9 No.4 505. 2勾)Bl日igh，E. G. & Dye付町r九， W.J.(ρ1959町)CanJ. Bio凹ch巴1l】Phys討iol.37， 911. 3) ROllser， G.， Kritchevsky， G. & Yamamoto， A. (1967) Lipid Chromatographic Analysis， Vol.l (Marinetti， G. V.， ed.， Dekker)， p.99. 4) Hirsch， J.H. & Ahren， E. H. Jr. (1958) J. liol. Chem. 233， 311. 5) Renkonnen， O.(1961)Biochim. Biophys. Acta fi4， 361. 6)久城英人，高野圭以，曾山浩吉，福井綴(1970)臨床病理， 18， 51. 7) Snyder， F.(1973)J. Chrolllatogr. 82， 7.8) 1m.谷昭司(1982)山形大学大学院農学研究科修士主主位論文.9)池田康行(1978)四国医誌， 34， No.1， 40. 10) Jackson， R. L.(1983)The Enzymes， Vo1.16， 3 rd Ed.(Boyer， P. D.， ed.， Academic Pres吋， p.141. 11) Higgins， J.A.(1982)J. Cell Sri. 53， 211. 12) Jain， M. 1<. (1980) Introduction to Biological Membranes (Jain， M. K. & Wagner， R. C.， cd.， John、Nileyand Sons， Inc.)p. 87. Snmmary 1. The lllechanism of the degradation of digly. cerides fonned dllring phospholipase C-treatment of rat Iiver microsollles was studied. 2. The amount of diglycerides fonned in the phospholipase C-treated microsomes was abollt 70% of that of phospholipids degraded and free fatty acids released abollt 20%. Diolein added to the microsolllal Iipase incubation medillm was hydrolyz巴das actively as o1ive oi1. 3. The microsomal lipase was activated by the treatment of phospholipase C 01' a sllal amollnt of chymotrypsin. The increased lipase activity of phos司pholipaseC-treated micl'osomes was inhibited remar. kably. by chymotrypsin. 4. Phenylmethanesulfonyl f1uoride inhibited remarkably the fatty acid Iiberation dllring the phospholipase C-treatment of llicrosomes. When microsomes were treated once with heparin， the 104 microsomal lipase. was released into th巴 heparinmedillm and the lipase activity of the heparin-treated microsomal pellet decreased markedly. 5. The phospholipase C-treated rOllgh micro. somes were subfractionated by the discoritinllollS slcrose density gradient centrifugation composed of 1.5 M， 1.3 M， and the treated microsomal suspension in 0.25 M sucrose from the bottom， and the distribll・tion of diglycerides and fatty acids was analyzed. The amollnt of diglycerides in the f10ating sllbfrac. tions was more concentrated than the pelleting subfraction. Saturated fatty acids were considerably more abundant than unsaturated fatty acids and the unsaturated decreased in the residllal phospholipid after p~ospholipase C action. The satllrated fatty acids of the fr巴efatty acid fl'action inoreased in the pelleting sllbfraction. 

Phospholipase類による生体膜の分解に関する研究(第2報) : ラット肝ミクロソームのPhospholipase C処理中に生成するジグリセリドの分解

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Phospholipase ルイニヨルセイタイマクノブンカイニカンスルケンキュウダイ2ホウ : ラットカンミクロソームノ Phospholipase C ショリチュウニセイセイスルジグリセリドノブンカイ

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Phospholipase ルイ ニヨル セイタイマク ノ ブンカイ ニカンスル ケンキュウ ダイ2ホウ : ラット カン ミクロソーム ノ Phospholipase C ショリチュウ ニ セイセイスル ジグリセリド ノ ブンカイ

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