上山 数弘

埼玉医科大学博士（医学）平成27年度thesi

上山, 数弘

ウエヤマ, カズヒロ

Ueyama, Kazuhiro

Saitama Medical University Repository

上山 数弘 内容の要旨                論文内容の要旨 現在、眼科診療において、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、血管新生緑内障、未熟児網膜症など、眼内血管新生病および網膜浮腫を起こす多くの疾患に、抗 VEGF 薬の硝子体注射が広く行われている。有効な治療ではあるが、頻回の注射が必要であるため、医学的・経済的な様々な負担を伴う。アデノウイルスベクター (Ad) を使用した遺伝子導入をドラッグデリバリーシステム(DDS) として利用し、数ヶ月間発現を維持できる遺伝子治療を開発できれば、これらの問題の解決につながっていくことが期待される。 Ad の利点としては、導入効率が高いこと、非分裂細胞にも導入されること、宿主ゲノムへ組み込まれることがないこと、一過性の遺伝子発現であることなどが挙げられる。上述の疾患に対する DDSとしてベクターを使用することを想定した場合、疾患のピークに合わせて遺伝子発現の調節ができれば十分である。臨床上、アデノウイルスは、感染症の原因として知られており、2014 年 3 月の時点で67 型まで確認されている。A～G の 7 つの subgroup に分類され、当研究で使用したアデノウイルス 5型は subgroup C、35 型は subgroup B2、28 型は subgroup D に分類される。受容体は、subgroup によって異なり、5 型はコクサッキーウイルスアデノウイルス受容体（CAR）と結合するが、35 型は CD46に結合する。一方、Ad、特に 5 型は、免疫反応が起きやすいことが知られている。成人の抗体保持率は、アデノウイルス 5 型では 60%程度であるが、35 型、28 型では保持率は低いため、本研究ではこれらの血清型を用い、5 型と比較検討した。 マウス眼に各血清型の Ad を硝子体内もしくは網膜下に投与し、眼内遺伝子導入効率とその局在を調べた。眼内の局在を調べるために、(Green Fluorescent Protein) GFP を発現するベクターとして、penton base のアルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) motif を削除し fiber に RGD motif を追加した Ad5+、改変のない Ad5-、fiber に RGD motif を追加した Ad35+、改変のない Ad35-・Ad28-を使氏  名      上山 数弘 学位の種類     博士（医学） 学位記番号     乙第 1293 号 学位授与の日付   平成 27 年 9 月 18 日 学位授与の要件   学位規則第 3 条第 1 項第 4 号に該当 学位申請論文タイトル及び掲載誌 Ocular Localization and Transduction by Adenoviral Vectors Are Serotype-Dependent and Can Be Modified by Inclusion of RGD Fiber Modifications アデノウイルスベクターの眼内遺伝子発現の局在と効率は血清型と fiber の RGD motif の追加の有無に依存する PLOS ONE 2014 Sep 18;9(9):e108071. doi: 10.1371/journal.pone.0108071. eCollection 2014.  2014 年 9 月 18 日 掲載 学位審査委員（主査）教授 赤塚 俊隆       （副査）教授 渡辺 修一、教授 三谷 幸之介、准教授 宮本 裕一 用した。遺伝子の発現効率を調べるため、Luciferase (Luc) を発現するベクターを投与後 1, 7, 14, 28, 180日に luciferase assay を行った。Luc を導入したベクターには、Ad5-、Ad35-、Ad28-を使用した。 Ad を用いた GFP の発現の局在は、硝子体注射では、Ad5-、Ad5+、Ad35+、Ad28-は角膜内皮、線維柱帯、虹彩に見られた。Ad35-は線維柱帯のみに遺伝子導入された。網膜下注射では、Ad5-、Ad5+、Ad35-、Ad35+は視細胞と網膜色素上皮細胞に遺伝子導入された。Ad28-は網膜色素上皮細胞のみに遺伝子導入された。Ad5-と Ad5+では局在に差がみられ、Ad5+では、網膜色素上皮細胞よりも視細胞のほうで蛍光が強かったが、Ad5-では網膜色素上皮細胞への導入が圧倒的に強かった。Ad35 では fiberへの RGD motif の追加による蛍光の差はみられなかった。 Luc を発現する Ad5-、Ad35-、Ad28-をマウスに硝子体注射もしくは網膜下注射し、遺伝子導入効率を評価した。すべてのベクターにおいて、Luc 発現レベルは硝子体注射後 1 日が最も高く、7 日、14日、28 日と低くなった。網膜下注射では、Ad5-は注射後 1 日で発現レベルが最も高く、注射後 14 日以降は低かった。Ad35-は注射後 7 日で発現レベルが最も高く、14 日以降は低かった。Ad28-は、注射後 28 日までは発現レベルが高かったが、180 日では低かった。ベクター間の比較では、注射後 28 日において、Ad35-と Ad28-は Ad5-と比較し統計学的に有意差をもった高い発現がみられ、注射後 180 日において、Ad35-は Ad5-と比較し統計学的に有意差をもった高い発現がみられた。 既報および本実験結果から、GFP を発現する Ad の網膜下注射における遺伝子導入の違いは、各血清型と改変された fiber に対する受容体の網膜内局在の違いが関係していると考えられ、penton base から RGD motif を削除することが視細胞へ遺伝子導入することの鍵と言えよう。Ad35 の受容体であるCD46 は血清プロテアーゼ補因子として働き、網膜色素上皮細胞やそれに関連したドルーゼンに存在する。これらの事実から、Ad35 は、CD46 に介在される網膜下の病変やドルーゼンなど加齢黄斑変性関連病巣に選択的に局在するのではないかという興味深い仮説がたてられる。この仮説の裏付けが得られれば、病変をターゲットとした遺伝子導入を構成する根拠となりうる。本実験において、アデノウイルス血清型と fiber の改変はマウスの網膜細胞において、ベクターの遺伝子導入と発現期間に影響を与えることが示された。網膜下注射においては、注射後の経過時間における導入効率も血清型により変化した。これらのデータは、Ad により特異的な細胞を標的とする際に、また、眼に長期的な発現を得ることを期待する際に、重要な所見と言える。特に Ad35 は網膜下注射した場合、導入遺伝子が 6ヶ月を超える期間発現した。Life span ではないが比較的長期間に、十分な遺伝子発現がみられるという特性は眼内血管新生および血管透過性亢進に伴う黄斑浮腫の治療に有用であると考えられる。また、既報で報告されている様に、fiber の改変は理論上、新生血管への Ad の親和性を高める可能性を持っていること、Ad35 の受容体である CD46 に介在される網膜下の病変やドルーゼンは加齢黄斑変性の病巣であり、ここに選択的に集積する可能性のあることが、これら改変 Ad の将来性を示唆する。従って、これらの病態に抗 VEGF 薬や血管新生抑制因子を発現する Ad35 を眼内投与する治療が、現状の抗 VEGF 薬の頻回投与という欠点を克服する治療法として期待される。   

Ocular Localization and Transduction by Adenoviral Vectors Are Serotype-Dependent and Can Be Modified by Inclusion of RGD Fiber Modifications

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