Neste trabalho, uma lacase de Oudemansiella canarii foi utilizada na degradação do corante azul brilhante de remazol R (RBBR). Análise por FTIR permitiu concluir que a lacase atuou não apenas no grupo cromóforo do corante, mas em toda a estrutura do corante, causando uma fragmentação efetiva da molécula. A ação da lacase causou uma redução significativa na toxicidade, conforme indicado pelo teste Microtox. Em conclusão, a lacase de O. canarii pode ser útil em futuras estratégias biológicas visando a degradação de corantes azo.Publicado no Anais Eletrônico da Galoá Proceddings

AMORIM, S. M.

BRACHT, A.

HELM, C. V.

MOREIRA, R. de F. P. M.

PERALTA, R. A.

PERALTA, R. M.

SCARATTI, G.

SILVA, G. B. da

UBER, T. M.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

  Universidade Estadual de Londrina - Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380 - Campus Universitário Caixa Postal 10.011 CEP 86057-970 Centro de Ciências Exatas - Departamento de Bioquímica e Biotecnologia Fone +55 (43) 3371.4270 - biq@uel.br Degradação e Detoxificação  do Corante Azul Brilhante de Remazol R pela Lacase de Oudemansiella canarii  Thaís Marques Uber1, Gabriel Bruno da Silva1, Gidiane Scaratti2, Suélen Maria Amorim2, Cristiane Vieira Helm3, Rosely A. Peralta2, Regina de Fátima Peralta Muniz Moreira2,  Adelar Bracht1, Rosane Marina Peralta1  1Universidade Estadual de Maringá, CEP 87 020-900 Maringá, Paraná. E-mail: (rmperalta@uem.br) 2Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina 3EMBRAPA-FLORESTAS, Colombo, PR  RESUMO Neste trabalho, uma lacase de Oudemansiella canarii foi utilizada na degradação do corante azul brilhante de remazol R (RBBR). Análise por FTIR permitiu concluir que a lacase atuou não apenas no grupo cromóforo do corante, mas em toda a estrutura do corante, causando uma fragmentação efetiva da molécula. A ação da lacase causou uma redução significativa na toxicidade, conforme indicado pelo teste Microtox. Em conclusão, a lacase de O. canarii pode ser útil em futuras estratégias biológicas visando a degradação de corantes azo. Palavras-chave: corantes sintéticos; lacase; azul reativo 19; Oudemansiella canarii.  INTRODUÇÃO Enormes quantidades de corantes sintéticos são lançados no meio ambiente causando um sério impacto ambiental no ecossistema. A remoção de corantes dos efluentes antes da sua descarga no meio ambiente é, portanto, uma questão de grande importância. A poluição da água com corantes é claramente visível impedindo a penetração de luz na água e interferindo diretamente na sobrevivência de organismos aquáticos. O corante azul brilhante de remazol R (RBBR) (azul reativo 19, C22H16N2Na2O11S3, massa molecular 626,53 g/mol) é um corante antraquinônico largamente utilizado na indústria têxtil (Fig. 1).     Figura 1. Estrutura química do corante azul brilhante de remazol R (RBBR)    https://proceedings.science/p/108520  Universidade Estadual de Londrina - Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380 - Campus Universitário Caixa Postal 10.011 CEP 86057-970 Centro de Ciências Exatas - Departamento de Bioquímica e Biotecnologia Fone +55 (43) 3371.4270 - biq@uel.br Por ser um organo-poluente tóxico e recalcitrante, sua degradação é altamente desejável. Atualmente, os efluentes contendo corantes são tratados principalmente por métodos físicos e químicos. No entanto, esses métodos apresentam várias desvantagens, como geração de lodo, alto custo e uso de grandes quantidades de produtos químicos. Isso tem impulsionado a busca por métodos biológicos alternativos, utilizando microrganismos e suas enzimas, especialmente as peroxidases e oxidases. Dentre as diferentes enzimas oxidativas secretadas pelos fungos ligninolíticos, as lacases (EC 1.10.3.2) têm sido bastante exploradas na degradação de corantes, pois catalisam a oxidação de uma grande variedade de compostos fenólicos e não- fenólicos e necessitam apenas de oxigênio molecular como co-substrato (PERALTA et al. 2017).  Oudemansiella canarii, um basideomiceto ligninolítico da ordem Agaricales, é comum em vários biomas brasileiros, incluindo a Mata Atlântica, a Amazônia e o Pantanal. Estudos prévios realizados em nosso laboratório têm demonstrado a habilidade da lacase de O. canarii degradar eficientemente o corante azo vermelho do Congo (IARK et al. 2019). O objetivo do presente estudo foi avaliar a capacidade da lacase de O. canarii em degradar o RBBR. MATERIAL E MÉTODOS Oudemansiella canarii foi identificado e gentilmente cedido pela Embrapa-Floresta, Colombo, PR. O fungo foi mantido em laboratório através de repiques sucessivos em ágar-batata-dextrose.  Para a produção de lacase, discos miceliais de O. canarii (diâmetro de 10 mm) foram transferidos para frascos Erlenmeyer (0,25 L) contendo uma mistura de 2,5 g de bagaço de cana e 2,5 g de farelo de trigo como substrato e 15 mL de solução mineral. Os cultivos foram mantidos por 14 dias a  28 °C na ausência de luz. A lacase foi extraída pela adição de água aos cultivos. Após centrifugação, o extrato enzimático foi dialisado contra água destilada e concentrado por liofilização (IARK et al. 2019).  Os ensaios de descoloração foram conduzidos em tampão acetato 50 mM (pH 5,0) em frascos Erlenmeyer de 250 mL, com volume total de 50 mL contendo 100 mg/L de RBBR e 5 U de lacase. As misturas foram incubadas a 30 °C no escuro num agitador rotativo a 100 rpm. Após 24 h de incubação, os espectros de absorção foram registrados na faixa de luz visível (400-800 nm). Os valores de absorbância a 595 nm foram utilizados para avaliar a descoloração em termos de porcentagem.  Para determinar os parâmetros cinéticos (velocidade máxima, Vmax e a constante de Michaelis-Menten, KM), as velocidades iniciais foram medidas a 30 oC e pH 5,0 utilizando concentrações de RBBR variando de 16 a 144 µM. A descoloração foi monitorada espectrofoto-metricamente seguindo a redução da absorbância inicial a 497 nm ao longo de um período de 2 minutos, imediatamente após o início da reação pela adição de 2 U de lacase. Para determinar KM e Vmax, a equação de Michaelis-Menten (v = Vmax[S]/(KM + [S])) foi ajustada diretamente aos dados experimentais usando o procedimento de ajuste não-linear de mínimos quadrados do Graph-Pad Prism. Software 5.0. As amostras de antes e após a ação da lacase foram submetidas à espectroscopia no infravermelho com  transformada de Fourier (FTIR) para análise dos grupos funcionais. Análise de toxicidade das amostras de antes e após da ação da lacase foi realizada utilizando o teste MICROTOX baseado na inibição da luz emitida pelo Vibrio fischeri (bioluminescência), de acordo com o protocolo ISO 11348-3:2007.   https://proceedings.science/p/108520  Universidade Estadual de Londrina - Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380 - Campus Universitário Caixa Postal 10.011 CEP 86057-970 Centro de Ciências Exatas - Departamento de Bioquímica e Biotecnologia Fone +55 (43) 3371.4270 - biq@uel.br RESULTADOS E DISCUSSÃO A lacase de O. canarii foi eficiente na descoloração do RBBR, ficando a solução corante gradativamente incolor em função do tempo de incubação. Após 24 h de incubação, a absorbância inicial a 595 nm foi reduzida em torno de 80%. A relação entre a velocidade inicial de descoloração e a concentração de corante obedeceu à cinética de Michaelis-Menten (R2=0,9899 (Fig. 1A-B) , em acordo com outros relatos  da literatura (MICHNIEWICZ et al. 2008; REZAI et al. 2015). O valor de KM  encontrado foi 114,90±15,63 µM e o valor de Vmax foi de 1,318±0,100 µmol/min. A mesma lacase apresentou para o corante vermelho do Congo, um KM de  46.180±6.245 µM, e uma Vmax de 1.840±0.101 µmol/min (IARK et al. 2019).      Figura 2. Descoloração do RBBR pela lacase de O. canarii. A: corante após  (1) e antes (2) da ação da lacase; B: Curva de absorção espectral do RBBR antes e após a degradação; (C) Efeito da concentração do RBBR sobre a velocidade de descoloração.  Para avaliar as transformações do RBBR catalisadas pela lacase, utilizou-se como ferramenta FTIR. Alterações acentuadas no FTIR de antes e após a ação da lacase sobre o RBBR podem ser observadas na Fig. 3, especialmente entre os números de onda 500-1500 cm-1.  500100015002000250030003500400030405060708090100110Anúmero de onda (cm-1)T(%)500100015002000250030003500400030405060708090100110Bnúmero de onda (cm-1)T(%) Figura 3. FTIR do RBBR antes (A) e após (B) o tratamento com a lacase de O. canarii   https://proceedings.science/p/108520  Universidade Estadual de Londrina - Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380 - Campus Universitário Caixa Postal 10.011 CEP 86057-970 Centro de Ciências Exatas - Departamento de Bioquímica e Biotecnologia Fone +55 (43) 3371.4270 - biq@uel.br A Fig. 4 apresenta a toxicidade relativa dos sistemas de incubação contendo RBBR antes e depois de um tratamento de 24 h com lacase. O ensaio Microtox detectou uma diminuição da toxicidade de 81,48±1,20% do corante para 3,00±2,00%  após 24 h de degradação do RBBR  pela lacase nativa de O. canarii. Os resultados indicam que a toxicidade estava intimamente associada à presença do RBBR uma vez que foi praticamente abolida pela lacase. Além disso, estes resultados sugerem que os produtos de degradação do RBBR são muito menos tóxicos do que o composto original.  0 20 40 60 80 100RBBR + lacase t= 0 hRBBR + lacase t= 24 hInibição (%)  Figura 4.  Mudanças na inibição da luminescência do Vibrio fischeri causada pelo RBBR  (100 mg/L)  tratado por 0 e 24 h com 5 U de lacase de O. canarii.  CONCLUSÕES  A lacase de O. canarii foi eficiente na descoloração do RBBR. Uma degradação efetiva, além da alteração do grupo cromóforo, é sugerida por FTIR. Uma efetiva redução na toxicidade foi encontrada em conseqüência da ação da lacase. Em conclusão, a lacase O. canarii pode ser usada em estratégias de biorremediação deste corante antraquinônico.  Agências de Fomento: Capes,  CNPQ e UEM.  REFERÊNCIAS IARK, D., BUZZO, A.J.R., GARCIA, J.A.A., CORREA, V.G., HELM, C.V., CORREA, R.C.G., PERALTA, R.A., PERALTA MUNIZ MOREIRA, R.F., BRACHT, A., PERALTA, R.M. Enzymatic degradation and detoxification of azo dye Congo red by a new laccase from Oudemansiella canarii. Bioresource Technology, v. 289, article 121655, 2019 MICHNIEWICZ, A., LEDAKOWICZ, S.,   ULLRICH, R.,  HOFRICHTER, M. Kinetics of the enzymatic decolorization of textile dyes by laccase from Cerrena unicolor.  Dyes and Pigments, v. 77, p. 295-302, 2008 PERALTA, R.M., SILVA, B.P., CÔRREA, R.C.G., KATO, C.G., SEIXA, F.A.V.S., BRACHT, A. Enzymes from Basidomycetes: peculiar and efficient tools for biotechnology. In: G Brahmachari, A.L. Demain and J.L. Adrio  (Eds), Biotechnology of Microbial Enzymes-Production, Biocatalysis and Industrial Applications.  (pp. 119-150). Elsevier, 2017 REZAEI, S., TAHMASBI, H., MOGHARABI, M., AMERI, A., FOROOTANFAR, H., KHOSHAYAND, M.R., FARAMARZI, M.A. Laccase-catalysed decolorization and detoxification of acid blue 92: statistical optimization, microtoxicity, kinetics, and energetics. Journal of  Environmental Health Science & Engineering, v. 16, p. 13-31, 2015 https://proceedings.science/p/108520Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Degradação e detoxificação do corante azul brilhante de Remazol R pela lacase de Oudemansiella canarii.

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Degradação e detoxificação do corante azul brilhante de Remazol R pela lacase de Oudemansiella canarii.

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