FELDMANN, F.

IDCZAK, E.

MACEDO, J. L. V. de

MÜLLER, I.

WERITZ, J.

Portuguese

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:MANEJO E REABILITAÇÃO DE ÁREASDEGRADADAS E FLORESTAS SECUNDÁRIAS NAAMAZÔNIA:Um Simpósio/Workshop Internacional18 a 22 de Abril de 1993Hotel TropicalSantarém, Pará - BrasilOrganizado por:Instituto Internacional de Floresta TropicalUSDA Serviço FlorestalEstação Experimental Florestal do SulRío Piedras, Porto Rico, USAEMBRAPA/CPATUCentro de Pesquisa Agroflorestal da Amazônia OrientalBelém, Pará, BrasilEm colaboração com:Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dosRecursos Naturais Renováveis - IBAMASantarém, Pará - BrasilCom suporte financeiro de:Programa de Floresta TropicalDepartamento de Agricultura dos Estados UnidosServiço Florestal. Washington, DC, USAeMan and the Biosphere (MAB) ProgrammeUNESCOParis, FranceISOLAMENTO, SELEÇÃO E PRODUÇÃO DE FUNGOS MICORRÍZICOSVESICULAR-ARBUSCULARES (FMVAs) E SUA APLICAÇÃO EM SISTEMASDE POLYCULTIVOF.Feldmannl, I. MüIler1, J. Weritz2, J.L.v. Macedo-', E. Idczak!1Universitat Hamburg, Institut for Angewandte Botanik, Hamburg, Germany2Biologische Bundesanstalt, Institut for Pflanzenschutz im Gartenbau, Braunschweig, Germany3CPAA/EMBRAPA, AM, BrazilRESUMOA introdução de fungos micorrízicos vesicular-arbusculares (FMVAs)em sistemas agrícolas favorece o (crescimento e a vigor das culturas, especialmente em áreas abandonadas de solos pobres. Como um pré-requisito para aplicação dos simbiontes, os fungos devem ser isolados e selecionados levando em consideraçãoa sua eficiência para as plantas e sua adaptabilidade às condições ambientais no campo. São descritos osdiferentes métodos de isolamento e o processo de seleção. ~rodu ão, em grande escala, do fungo selecionadopode ser feita em casa-de-vegetação ou diretamente no campo:...A inoculação das plantas com o FMVAs épossivel tanto em viveiros como no campo. Dois métodos de aplicação são apresentados: inoculação dasplantas com uma mistura homogênea de inóculo no substrato e com uma camada concentrada de inóculo,respectivamente.INTRODUÇÃO(Nos habitats tropicais, o beneficio dos fungosmicorrizicos vesicular-arbusculares (FMVAs) parasuas plantas hospedeiras é de especial importância.O fornecimento mais eficiente de nutrientes pelosfungos determina maior crescimento das plantas nossolos pobres dos trópicos (Sieverding 1987;Lin 1986).Além disso, a colonização das raízes pelos fungosmicorrizicos aumenta a resistência das plantashospedeira a patógenos das raízes (Zambolim 1986)e reduz a severidade de doenças de folhas(Feldmann 1991). A tolerância de plantasmicorrizadas a "stress" (ex: temperaturas externas,umidade alta ou baixa e transplantio) geralmente émaior do que nas plantas não micorrizadas(Schonbeck 1987; Müller 1991). Nos sistemasagrícolas têm sido observada alta deficiência defungos simbiontes (Feldmann 1991). Para recuperara "vitalidade do solo" em relação a FMVAs, enecessário a aplicação de fungos na época dasemeadura ou do plantio no campo ou em viveiro.Em Manaus-AM, instalou-se um sistema depolicultivo de plantas perenes cujo manejo leva emconsideração as exigências dos fungos (menosfertilizantes, menos pesticidas e mais vegetaçãosecundária). A plantação foi estabelecida em umaárea abandonada (anteriormente era um plantio deseringueira). Para melhorar o "fitness ecológico" dasplantas, estas foram inoculadas com FMVAs noviveiro ou na época de plantio, no campo.Até o momento, o uso de FMVAs em sistemasde produção agrícola não é uma prática comumdevido, principalmente, as dificuldades envolvidasno isolamento, seleção, multiplicação e aplicação dosFMVAs. O objetivo deste trabalho é demonstrar osmétodos que envolvem desde o primeiro passo deisolamento dos fungos micorrízicos até o passo fi-nal de aplicação nos viveiros e no campo.ISOLAMENTO DE FUNGOS MICORRIZICOSVESICULAR-ARBUSCULARESOs FMVAspodem ser usados na forma de:isolados puros, derivados de culturasmonospóricas, ou polispóricas de umaespécie fúngicauma mistura de definidos isolados purosuma mistura de espécies de FMVAsdesconhecidas com estabilidade compro-vada da população e de seus efeitos.O estabelecimento de isolados puros (1) e deisolados de uma mistura desconhecida de FMVAs66(2) é mostrado na Figura 1. Em ambos os casos, osfungos originaram-se de solos do campo. Além dos -)esporos vivos de FMVAs, o solo de campofeqüentemente contém grande número de esporosmortos de fungos micorrizicos. Como consome-semuito tempo para se estabelecer isoladosmonospóricos diretamente das amostras originais docampo, preferiu-se aumentar o número de esporosvivos cultivando uma planta hospedeira (ex:milho,cebola, pimentão) no solo. Isso facilita a propagaçãodos fungos no substrato. Uma desvantagem dessemétodo de aumentar o número de esporos vivos deFMVAsé a possibilidade da pré-seleção de fungosque sejam mais adaptados a determinadas condiçõesde crescimento. Para minimizar essa pré-seleção,recomenda-se o uso de diferentes espécies de plantasem diferentes condições de crescimento. Quatro aoito semanas, após o semeio ou plantio, as raízesdas plantas estarão colonizadas pelos FMVAs. Parao estabelecimento de isolados puros, as plantasdevem ser removidas do substrato e as raízes,totalmente enxagüadas. Para evitar a contaminaçãocom patógenos de raízes, recomenda-se desinfectaras superficies (ex: com etanol). As plantas sãotransplantadas para sacos de plástico ou outrosrecipientes tais como:vasos ou caixas contendo umsubstrato poroso. Elassão irrigadas moderadamentee adubadas uma vezpor semana, com um fertilizantecom baixo teor de fósforo (P < 60 ppm). Após umperiodo de crescimento de oito semanas, as plantasnão são mais irrigadas, induzindo a produção deesporos dos FMVAs. Os esporos devem serremovidos do substrato pelo método depeneiramento úmido e centrifugação (Daniels andSkipper 1984; Feldmann 1991). Para estabelecerculturas puras, o processo descrito é repetido comum único esporo de fonte de inóculo (isoladomonospórico) ou com diversos espores da mesmaespécie fúngica (isolado polospórico), o quefreqüentemente é problemático porque é difícildeterminar se esporos similares pertencem à mesmaespécie. Para a produção de um isolado de FMVAs,contendo uma mistura desconhecida de espécies deFMVAs (2), diversos passos do processo descritoanteriormente podem ser omitidos (ver Figure 1).Além disso, é possível extrair os esporos de FMVAsdiretamente do solo do campo e usá-los comoinóculo primário. Esse método diminuirá acontaminação com patógenos, que podem estarpresentes no solo.!Isolamento de FMVA!CuIU .•.•' ai pl.nt •• hOIP.d.I,udo FU'" no .010 I'M', milho}1 ~I ._ !amoslr. de aOlol··••••~': ••• ;:: ••••••• : ••; 0'-IProdução de inóculo IFIGURA 1. Processo de isolamento de FMVAs.(1) isolado puro; (2) isolado de uma mistura desconhecida de FMVAs.R.nlo.•.•r Ii pl."'" do .0101r-6••. 1) "."".nu. '•.•.•,,,,dO., 1'1",..' ,.dlr:ul.u,•l'I",pll"II' Ii pl,"ll'",lcarrll'dU Plr. conl.ll'I.r •• "c •..•dos COI'l'lIUbllllllo pOfl)~ncusu .•.•' '1 pIIAII. (lu,.n',e ""'1'1"1I, '2• •ro;i'lIl' Ia pl." •••••• eal.'"E,mlnt. no 'Ub'HIIG,ElI"'" o•• ,poro. dO n .•..•.do .",1>•• ,.10,•AapIUr do. p,"oa d•• erlloIclll'll to.- Ipln •• "'ri 'IPoroCOntO lontl d. InOculo_...L-- .... O]E_Irei' 01 "pOIOI ~. FU •.••..............•. do 8010 por panelrAma"l",• c:anlllluoaçlo--------: ..... ,- ..I Seleção!I~ .'67Antes de se estabelecer que os isolados deFMVAs podem ser usados em viveiros ou em umaescala agrícola, eles devem ser selecionados comrelação as suas efetividades.SELEÇÃO DE ISOLADOS EFETIVOS DE FMVASApesar de os FMVAs estarem distribuidos emtodo o mundo e da maioria das espécies de plantasviverem em simbiose com esses fungos, existe umaespecificidade na interação entre fungos e plantashospedeiras (Estaún et aI. 1987; Graw et a!. 1979;Idczak 1992). A especificidade é revelada emrelação a:planta hospedeira (espécies de plantas /cultivar da planta)natureza do efeito (o qual depende tambémdas condições ambientais).Portanto, é necessária a seleção de isoladosefetivos de FMVAs.PROCESSO DE SELEÇÃO:Listar:* a natureza dos efeito(s) desejado(s) (ex:aumento do crescimento da planta,aumento da resistência a patógenos etc),os fatores abióticos, que durante aseleção devem ser semelhantes àscondições nas quais os fungos deverãoser usados (substrato, temperatura, pHetc).*Asegurar a infectividade do inóculo fúngico,testando-a (checar se uma planta hospedeirapotencial, ex: milho, é colonizado porfungos).Determinar se a planta, para a qual o isoladofúngico está sendo selecionado, émicotrófica (Janos 1987; Feldmann 1991),isto é, testar se os FMVAs são capazes decolonizar as raízes e se as plantasmicorrizadas estão sendo beneficiadas pelasimbiose.Se a planta é micotrófica, analizar o grau dedependência micorrízica (dependênciafacultativa ou obrigatória, Feldmann 1991).Determinar, novamente, os fatores abióticosde seleção, considerando o grau dedependência, as condições na área onde osfungos serão usados e o tipo de manejo.Comparar a efetividade dos isolados comrespeito ao efeito desejado.Em adição aos passos descritos na seleção deisolados efetivos de FMVAs, há outros fatôres quedevem ser considerados durante o processo deseleção, tais como a habilidade competitiva e apersistência dos fungos sob as condições naturais(Abbot et aI. 1992). Após a escolha dos isolados dosFMVAs, a produção de inóculo em grande escala éum pré-requesito para aplicação em viveiro ou nocampo.PRODUÇÃO DO INÓCULOUma descrição detalhada da produção 'deinóculo de FMVAa ser usada nos trópicos, tem sidoapresentado por Feldmann and Idczak (1992). Dessaforma, são descritos apenas os principais aspectosda produção de inóculo.A produção de inóculo pode ser diferenciadaentre uma fase inicial (Figure 2) e a produção massal(Figure 3).Fase inicial:Encher dois terços de um vaso (cerca de 500ml) com areia quartzosa e uma camada deinóculo primário (solo contendo os FMVAs,pedaços de raízes infectadas ou esporosfúngicos) no topo.Desinfectar superficialmente as sementes deuma planta hospedeira (ex: milho),enxagüá-las com água para remover todospesticidas, semeá-Ias no vaso e cobri-Iascomareia.Irrigar os vasos moderadamente (aumidadedo substrato deverá ficar um pouco abaixoda capacidade de campo) e adubar asplantas com fertilizante com baixo teor defósforo (P < 60 ppm, para detalhes verFeldmann and Idczak 1992). Evitar o usode pesticidas.Após um período de crescimento de três aquatro semanas, as raízes da planta68A BcFIGURA 2. Fase inicial da produção de inóculo(Feldmann & Idczak 1992). Ver texto paradetalhes.BFIGURA 3. Produção massal de inóculo(Feldmann & Idczak 1992). Ver texto paradetalhes.69hospedeira deverão estar colonizadas pelosFMVAs. Controlar a colonização das raízespor meio de um microscópio. No caso debaixa infectividade do inóculo primário operíodo de cultivo pode ser estendido poruma ou duas semanas.Quando as raízes da planta hospedeiraestiverem bem colonizadas, separar asplantas e lavar as raízes. Algumas vezespode ser que haja necessidade de desinfectara superfície das raízes (etanol 70%, 2 min.)para eliminar fitopatógenos.As plantas tratadas desse modo são usadaspara produção massa! de inóculo FMVAs.Produçao massaI:As plantas micorrizadas são transplantadaspara vasos maiores (volume com cerca de 51) ou containers semelhantes, os quaispodem ser maiores mas que permitam aexploração de todo o volume do solo, pelasraízes. O uso de argila expandida, comosubstrato, (método descrito por Dehne andBackhaus 1986) tem várias vantagens, taiscomo: baixo peso, fácil aplicação e o fato deque a cantaminação por patógenos pode serfacilmente evitada e também seja possíveluma descontaminação subseqüente. Outrossubstratos, como solos arenososesterilizados, podem também ser usados.Irrigação e adubação devem ser executadasconforme descrito na fase inicial.Após três a quatro meses de crescimento dasplantas, as raízes deverão ocupar o volumeinteiro do container. A partir dessemomento, suspende-se as irrigações. Ostress da seca estimula a produção deesporos de FMVAs. Uma semana após otérmino da irrigação, as plantas são cortadase os VASOScoam as raízes são mantidossecos, durante duas semanas. Após esteperíodo, remove-se as raízes do substrato.O substrato é espalhado em camada fina erapidamente seco ao ar. O inóculo seco deveser armazenado sob condições seca e fria,por mais de um ano.Alternativamente ao processo de produção deinóculo descrito acima, a multiplicação de FMVAspode ser feita diretamente no campo (produção "insitu"). Feldmann (1991) relata que a inoculação deplantas hospedeiras (ex: milho) com FMVAs nocampo, na época da semeadura ou do plantio, resultaem um aumento do número de esporos de FMVAsem tomo de 4 a 57 esporos/ g de solo, após doismeses.APLICAÇÃO DE INÓCULO DE FMVAA inoculação de plantas com fungosmicorrízicos pode ser feita de diversos modos:o inóculo fúngico pode ser misturado deforma homogênea com o substrato decrescimento das plantas.Uma camada concentrada de inóculo podeser colocada abaixo das sementes ou dasraízes das plantas.o método de inoculação e a quantidade deinóculo aplicado (O; 0,2; 1,0; 5,0 e 10% vol.)determinam o desenvolvimento da associaçãomicorrízica (Figure 4).o maior índice de colonização das raízes demudas de seringueira (Hevea sp.) é conseguidousando mais de 1% (v/v) de inóculo no substrato.A distribuição homogênea do inóculo leva a ummaior grau de colonização das raízes, quandocomparado com o método de "aplicaçãoconcentrada", embora uma porcentagem maior decolonização das raízes seja conseguido com o últimométodo, durante os estágios iniciais dedesenvolvimento da simbiose. Isso provavelmenteseja devido ao fato de que no caso da "aplicaçãoconcentrada", as raízes de uma muda contactem umgrande número de unidades de infecção, quandocrescem através da camada de inóculo. Nestemomento, ocorre uma infecção pesada no sistemaradicular. Após as raizes atravessarem a camada deinóculo, não existem mais unidades de infecção deFIGURA 4. Colonização das raizes por FMVA em função do método de aplicação e da concentração deináculo aplicada.mistura homogêneacolonlzaçio di' raln. '''1eo~--~------------------------~50"'o _.20 30 40dia. apó. InooulaQi'o50-- 0,0"" tnbe. .'~ 0.1'11htOc. --- 1.0'11 IftOo.-4'>-- '.0" Into. .....- tO.O •• I~.aplicação concentradaJoOlon'lIçi"o d•• raiz •• ,•• ,"'0r--------------------------- __~O~----~----~----~----~----~10 20 30 ",O 50di•• apó. Inoculaç.o10 110- 0.0" Into. .-~- O," InOo. . *- t.o" teee......q,.. _,O" "'tc. -w._ 10.0" '"Oc.70FMVAs. O fungo tem que se sepalhar por todo osistema radicular, a partir do sitio dos pontos deinfecção primária. No caso da distribuiçãohomogênea do inóculo fúngico, são possíveis novasinfecções nas raízes pelo fungo, mesmo após umlongo período de desenvolvimento do sistemaradicular. Por essa razão, recomenda-se aplicar oinóculo na forma de mistura homogênea, mas a"aplicação concentrada" também tem sido bemsucedida no campo.o USO DE FMVAS EM SISTEMAS DEPOLICULTIVOA introdução de FMVAsem sistemas agrícolascomoum fator de manejo é simples. Se o isolamento,a seleção e a produção do inóculo primário sãoefetuados por institutos oficiais ou companhiasespecializadas, o produtor tem que multiplicar oinóculo em grande escala. Isso pode ser feito emcontainers contendo areia ou solo porosoesterilizado. O inóculo produzido é usado parainoculação das plantas no viveiro, misturado deforma homogênea com o substrato. Nessa situação,as plantas já estarão micorrizadas quando entãoserão transplantadas para o campo. Isso serábenéfico para as plantas durante a primeira fasecriticade adaptação às novas condiçõesde ambiente.Se o agricultor desejar inocular plantas perenesnão micorrizadas que já estão no campo, deverá usar"plantas govemantes". Isso significa que deverásemear ou plantar espéciesl que freqüentemente sãousadas na produção de inóculo (ex:milho), próximodas plantas perenes e inoculadas com FMVAs. As"plantas govemantes" multiplicarão o inóculo deFMVAs no solo, e as raízesizes dessas plantasmicorrizadas crescerãopróximo às raízes das plantasperenes e, assim, inoculá-Ias. Se omanejo no plantiofor feito de acordo com as exigências de FMVAs(menos ferilizantes e pesticidas e mais vegetaçãosecundária), os fungos poderão se estabelecer nocampo.REFERÊNCIASAbbot, L.K.; Robson, AD. and Gazey, C. (1992). Selec-tion of inoculant vesicular-arbuscular mycorrhizalfungi. In: Norris, J.R.; Read, D.J. and Varma, AK.(eds.): Methods in Microbiology, Volume 24, Aca-demic Press, London, pp 1-21.Daniels, B.A. and Skipper, H.D. (1984). Methods for therecovery and quantitative estimation of propagulesfrom soi!. In: Schenck, N.C. (ed.): Methods and prin-cipIes of mycorrhizal research. Am. Phytopath. Soc.,St. Paul, MI, USA, pp 29-35.Dehne, H.W. and Backhaus, G.S. (1986). The use of VAMin plant production 1. Inoculum production. Z.Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz 93:415-424.tEstaún, Y.; Calvet, C. and Hayman, D.S. (1987). Influenceof plant genotype on mycorrhizal infection: responseof three pea cultivars. Plant and Soi!103:295-298.Graw, D.; Moawad, M. and Rehrn, S. (1979). Host speci-ficity and the effectiveness of VA-mycorrhiza. Z. fürAcker- und Pflanzenbaur 148 (2):85-98.Feldmann, F. (1991). Die Mykorrhiza desKautschukbaumes Hevea spec. Muell. Arg.:Vorkommen am Naturstandort und in Plantagen,Wirkung auf das Resistenzverhalten, Nutzung imPlantagenbau. Dissertation, Technische UniversitatBraunschweig, 148 pp.Feldmann, F. andIdczak, E. (1992). Inoculum produc-tion of vesiculararbuscular mycorrhizal fungi for usein tropical nurseries. In: Norris, J.R.; Read, D.J. andVarma, AK. (eds.): Methods in Microbiology, Volume24, Academic Press, London, pp 339-357Idczak, E. (1992). Wechselwirkung zwischen VA-Mykorrhizapilzen und Nutzpflanzen: Isolat- undSortenspezifitat, Biochemie und Physiologie derWurzel, Pathogenabwehr. Dissertation, UniversitatHamburg, 142pp.I[anos, D.P. (1987).VAmycorrhizas in humid tropical eco-systems. In: Safir, G.R. (ed.): Ecophysiology of VAmycorrhizal plants, CRC Press, Boca Raton, Florida,USA, 107-134.1t'Lin, M.T. (1986).Uso de micorrhizas em fruticultura. Rev.\Bras. Frutic. (Cruz das Almas, BA) 8(3):47-55. ~Sieverding, E. (1987). On farm production of VAM in-oculum. In: Sylvia, D.M.; Hung, L.L. and Graham,J.H.: Proceedings of the 7th North American Confer-ence on Mycorrhizae (NACOM), Gainesville, Florida,p284.71

Isolamento, seleção e produção de fungos micorrízicos vesicular-arbusculares (FMVAs) e sua aplicação em sistemas de polycultivo.

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