Estudio de las crestas, barbillas y orejuelas a nivel histoquímico utilizando diversos métodos clásicos da diferenciación. Se presenta un cuadro comparativo de los resultados metacromáticos a diferente pH de las estructuras estudiadas

Cevallos Bohórquez, Carlos

Estudio de las crestas, barbillas y orejuelas a nivel histoquímico utilizando diversos métodos clásicos da diferenciación. Se presenta un cuadro comparativo de los resultados metacromáticos a diferente pH de las estructuras estudiadas.Ministerio de Cultur

Repositorio Institucional de la Universidad de Oviedo

ESTUDIO HISTOQUIMICO DE LA CRESTA, BARBILLAS Y OREJUELAS DE Gallus domesticl~s L. Por  CARLOS CEVALLOS BOHORQUEZ Departamento Inierfaculta~ivo de Morfologa R.licroscópica. Universidad de Oviedo. RESUMEN S e  estudian las crestas,  barbillas y orejuelas a nivel histoquírnico, utilizando diversos métodos clásicos d a  difrreiic:iación. Al final presentarnos un cuadro comparativo d e  los resultados metacromá- ticos a dilerente pH de las estructuras estudiadas. INTRODUCCION En trabajos anteriores hemos realizado estudios a nivel estructural y ul- traestructural, de  los apéndices cefálicos del Gul f i~s  domest ic~~s  L. (crestas, barbi- Has y orejurlas), CEVALLOS BOI-IORQUEZ, C. ,  1972-1975 (3a-3b), estableciendo nive- les de comparación con trabajos como los de  BoYL~:, J., 1 9 a  (8), RIZZOLI, C. E., 1950 (19); SZIRNAI, J. (21-22), BOAS, N.  F., lgLt9 (3) y otros a nivel estructural, ultraestructural e histoquimico. En cuanto a este último punto el d e  la histoquí- mica, objeto del presente trabajo, hemos realizado análisis d e  los apéndices crfálicos utilizando métodos clásicos, encontrando algunas diferencias notables entre las reacciones que se  realizan en las diversas estructuras de  las crestas, barbillas y orejuelas, haciendo surgir nuevamente tan intensamente estudio, tan íntimamente ligado al campo de  la histofisiología, patología aviar y al d e  la productividad avícola. MATERIALES Y METODOS Para el estudio histoquímico hemos utilizado ejemplares jóvenes (dos me- ses y cuatro meses) d e  Gallus domesticus L. (híbridos), machos en  condiciones normales y sin ninguna tara patológica. Fueron sacrificados por decapitación, y las crestas ,  bart)illas,y orejuelas fijadas d e  acuerdo a los métodos por realizar, a fin d e  poner e n  evidencia la:, diferentes reacciones histoquímicas a estudiar.  S e  hicieron cortes d e  8 p, 10 p y 16 p. Los métodos d e  tinción utilizados han sido el PAS,  el verde de  metilo pironina-Pappenheim-Unna, reacción d e  Feulgen y el azul d e  toluidina al 0,2 en solución tampón a p H  3; 3,5; 4,2, 7 y 9. Los fijadores empleados fueron formo1 neutro 10 c c ,  agua destilada 90 cc:, acetato d e  plomo a saturación. Bouin y formo1 al 15 % para congelación. ANALISIS HISTOQUIMICO Y OBSERVACIONES L a s  observaciones a nivel histoquímico, l as  hemos realizado con el si- guiente  planteamiento: 1) Análisis d e  la capa  epidérmica. 2) Análisis d e  la c a p a  dérmica. 3) Estudio d e  la zona del tejido mucoso. En todas es tas  regiones hemos realizado un estudio comparativo d e  la presencia d e  mucopolisacáridos y ácidos nucléicos. Observaciones de la capa epidérmica y de la dermis En nuestras  observaciones hechas con el método del PAS,  hemos podido constatar  e n  la capa  reticular d e  la zona sub  epitelial d e  la cresta  y barbillas, la presencia  d e  gran número d e  vasos sanguíneos sinusoidales. Estos vasos s e  muestran e n  cambio ausen tes  en las  orejuelas, e n  donde hay solamente una pequeña banda d e  tejido muy similar a la capa  reticular d e  la cresta y barbillas. E n  la capa  dérrnica d e  la cresta ,  barbillas y orejuelas, s e  encuentran en cambio fibras colágenas d e  aspecto homogéneo, y vasos sanguíneos e n  espiral (Fotos A y B). Los resultados observados con la técnica del PAS,  fueron los siguientes, d e s d e  la zona superficial hacia l a  par te  más  profunda: 1." Intensa reacción P A S  positiva e n  c a p a  córnea. 2.O Positividad más  débil o ausencia d e  reacción PAS positiva, e n  capas espinosas y basal del epitelio; intensa P A S  positividad en la membrana basal del epitelio. 3.O P A S  positivo e n  las  paredes d e  los vasos sanguíneos y también en el tejido conectivo situado inmediatamente por debajo del epitelio. 4 . O  Zona P A S  negativa. 5.O Más hacia adentro tejido conectivo P A S  positivo. 6.O Células sanguíneas P A S  positivas, lo mismo q u e  la zona mucosa. 7.' Tejido mixomatoso, constituido por células estrelladas con sustancia fundamental metarromática (como veremos más adelante con las tinriones de  azul de  touidina realizados a diferentes pH). Las orejuelas presentan las mismas característi(:as que las crestas, en 10 que respecta a la reacción del PAS. La reacci611 1'AS positiva, fue observada especialmente intensa en la membrana basal del epitelio pavimentoso de  revestimiento y en la capa córnea. La PAS positividad s e  presentó también, en paredes vasculares y en algunos haces d e  fibras ro lág~nas .  Esta misma reacción se  encontró con intensidad uniforme en la zona media. Observaciones pn la barbilla con la. tinción de Feulgen Hemos observado que los nucleolos d e  las células de  las capas basal y espinosa, s e  rnustraron negativos a la reacción de Feulgen. Fueron en cambio positivos los núcleos, especialmente los de las células sanguíneas. S e  observó gran acúmulo de  linfocitos alrededor de  los vasos. Observaciones con el verde metilo pir0nin.a Los nucleolos mostraron intensa coloración con l a  pironina (buena tinción del RNA), observándose que el DNA se  coloreaba en verde. La coloración del DNA por verde d e  metilo, mostraba distribución semejantes a la revelada por la técnica d e  Feulgen. Con este último método no s e  tiñen las capas de  queratina, pero se puede notar bien la zona de  transición. S e  parecía una transici6n desde la capa hasal a la zona epidérmica quera- tinizada, observándose disminución d e  la tinción de los núcleos, los cuales se  hacen cada vez menos visibles a medida que nos acercamos a la capa cbrnea. Análisis del tejido mucoso El análisis del tejido mucoso, lo hemos realizado utilizando los métodos dr1 PAS y la metacromasia con azul de  toluidina. Indudablemente, el estudio de las reacciones del PAS en cada una de estas estructuras nos ha llevado a demostrar la presencia de  polisacáridos en diclios tejidos, y como veremos en su capítulo correspondiente, los materiales rnetacromáticos fueron observados casi exclusivamente en el espacio interfibrilar d e  la rapa  rnucoide. La capa mucoide está ligeramente teñida en comparaci6n con la intensa reacción de  la capa del tejido conectivo. En la capa mucoide, la metacromasia s e  localiza en la sustancia fundamen- tal, entre las fibras, mientras que la sustancia PAS positiva está asociada estric- tamente a las fibras mismas. En la capa mucoide las fibras son sólo estructuras r!íJ positivas. Al teñir con el PAS obtuvimos un color rojo intenso, índice de  un gran contenido en mucopolisacáridos neutros. cresta: mente diferen La reacción d e  PAS s e  observó negativa en la sustancia mucoide d e  la , pero menos pronunciada o casi imperceptible en las orejuelas. Bien podemos decir por nuestras observaciones, que  el PAS tiñe positiva- a las fibras colágenas. ESTUDIO DE LAS ZONAS DEL TEJIDO MUCOSO CON LA REACCION METACROMATICA El análisis histoquímico s e  realizí, utilizando la reacción metacromática con : toluidina. Las variaciones que hemos observado han sido conseguidas utilizando pH a its escalas. Nuf:stras observaciones nos han dado los siguientes resultados: Mt-tacromasia con azul de tnluidina (pH 4,2). S e  observó una fuerte meta- L I ~ J I I I ~ ~ ~ ~  tbri (21 tejido mucoide (Fot. l-2), correspondiente a los mucopolisacáridos ácidos, que  s e  manifiestan en forma de  color rojo púrpura. Tal  metacromasia disminuyó en la zona inferior en donde observamos más bien una abundancia de vasos PAS positivos. Utilizando iin pH más bajo, del orden de  3,5, los niucopolisacáridos carbo- xilados ya no deben mostrar reacción metacromática, pudiendo d e  ese  modo distinguir, si la metacromasia es debida a grupos carboxilados o a otros grupos ácidos. Es así como las metacromasias observadas a estos pH bajos podemos considerarlos debido a la presencia d e  fosfornucopolisacáridos y de  sulfomucopo- lisacáridos. Continuando bajando el pH, observamos que a pH 3 desaparecen la meta- cromasias, por lo que puede decirse que la metacromasia de  las barbillas es debida a la presencia de mucopolisacáridos ácidos carboxilados. Crestas En las crestas observamos una metacromasia más marcada que en  las barbillas. Los mucopolisacáridos ácidos s e  encuentran concentrados en la capa fundamental, integrando las zonas interfihrilares en donde está ampliamente repartido el tejido mucoide. Sin embargo la zona central constituida por los grandes vasos, no s e  tiñe metacromáticamente. Utilizando pH 3,5 observamos que las metacromasias s e  siguen presen- tando intensas en  la zona del tejido mucoide, pero no en  las fibras colágenas. Las zonas epidérmicas profundas y dérmicas dan en  cambio metacromasia negativa. R E A C C I ~ N  METACROMATICA Las ilustracionee que presentamos eii blanco y negro nos rnucbstrari zoiias más o menos oscuras que representan zorius de rnayoi o menor reacción nietacrornáticu. j \! i** * * '  ? .a,% *- &a4 r-6 3 3 % .  - L t m.? * rfir':-i k+. 4 *Y L.' Foto 2 Foto 1-2.-Barbillas de Callus dornesticus L. ~eñidas con azul de toluidina (pH 4.2). Fuerte rnetacrt3ma- cia en el tejido rnucoide. 212 Segun nuestras  observaciones, por lo tanto s e  demues t ra  la presencia  d e  mucopo- lisac'áridos carboxílicos, ya que  observando estas  mismas c4rcstas a un pH 3 ,  s e  I ~ ~ d o  trtiservar disininiición d e  la intensidad d e  la metacromasia .  Es ta  disininución correspondería por lo tanto a In aitseti<:ia d e  reacciones d e  mucopo1isac:áridos ri1ií:os a pH tan bajo. 111 aunirntar  los pH a 4,2 7 y 9 (Fot. 3-4), pudimos evidenciar incremento ,., ... intensidad d e  la mt,tacromasia, observando nienos diferencia d e  ciiclia intrnsitiad cii Iai; tlit'erentcs regiones estudiacias. Tal  e s  el caso  d r  las  ohservacio- iirs Iie(*lias a p H  9. Esto es  probablemente debido a clur e n  los lugares en donde 6.- nids ~ i c e n t u a d a  la meta<:rurnasia existen rnenos mucopolisacáridos fosforados o atados q u e  mucopolisa<:líiirios car1)oxílicos. En las orejuelas hemos observado una metacromasia  mucho más  marcada  a pH 4,2 (Fot. S), con una especial diferenciación. Se observa en cambio una baja de esta tnetacromasia a p H  7 ,  ocasiona pérdida d e  la diferenciación entre  e1 tejido niiicnso y 11)s elementos interf'ibrilares. aunque  persisten aún ligeras diferencia- ciones ti? la metarromasia estudiada a pH 7 y 9, hecho contrario d e  lo que  hemos podidu o b s e r ~ a r  e n  las crestas  y barl)illüs. En cuanto a nuestras  observacioncs e n  l a s  capas  fibrosas intercelulares, ninguna reaccitíri da color cspecífico pudo s e r  detectada.  C~rcítlro cornl)rírntivo tlc la  rcnccicín rnctacrom6/ica de las crestas, barbillas y orry~~elics de CILIIILS domestirus L. DISCUSION Como habíamos señalado e n  trabajos anteriores (3a-3b), pocos trabajos a nivel histoqi~ímico s e  han  realizado (le las  c res tas ,  barbillas y orejiielas d e  Gnllrls rlnmesticr~s L. Sin embargo algunos trabajos especializados s e  han  realizado al respecto, como los d e  SZIRXIAI,  J. (21-22), referente  a la copa fundamental  d e  la rapa mucoide d e  la cresta  del pollo respondiendo favorablemente a la reacción metacromática, pero e s  negativa a la reacción d e  PAS, las fibras son PAS positivas. Es ta  observación d e  SZIRMAI coincide plenamente con nuestros resulta- Foto 3 Foto 4 Foto 3-4.-Creslas de Callus domes t i c~~s  L. teñidas con azul de ioluidina (pH 4,2 y 7). Aumento de la intensidad de la metacromacia. . -. . ... , ,- 3 a*?, - 4; Foto 5.-Oiejurl:~ de GIILLLII.F d v ~ » ( ' ~ t i ~ . ~ ~ . s  L. teñidas con azul de  toliiidina (pH 4,2). Matacroniaria inuclio rnjs marcada con especial dif(~renciari6n. dos, sin embargo nosotros hemos encontrado que cuando existe un aumento del pH, aumenta la metacromacia y si bajamos el pH desaparece la metacromacia. En cuanto a la presencia de la reacción PAS, del mismo modo pudimos comprobar que es negativo en la sustancia mucoide de  la cresta, siendo positiva en cambio en las fibras. En el estudio d e  las barbillas s e  encontró la misma reacción de  PAS que en las crestas, pero fue menos pronunciada en las orejuelas, DOYLE (6), nos dice que aproxiinadarnente la mitad de  la acumulacjón total en proteínas de la cresta, s e  encontró que era colágena, esta proporción está relati- vamente constante durante el periodo d e  regresión. El total de  la acumulación de  colágena, es similar a la total aparición de la proteína, esto parece estar relacio- nado con el peso. Nosotros hemos comprobado estas reacciones utilizando en nuestras ob- servaciones el verde de  metilo pironina, en la cual hemos observado una buena tinción del RNA, observando que el DNA se  tiñe en verde, mediante el método de Feulgen comprobamos que los nucleolos de las células de la capa basa1 y espi- nosa, se  mostraron negativos a la reacción d e  Feulgen. BIBLIOGRAFIA BENCIT, J. (1929).-Le determinisme des caractéres sexuels secondaires dii coq domestique. Arch. Zool. Exp., t. 69. pp. 1-499. BERDINIKOFF, A. y CHAMPY. Ch. (1931).-Recherches sur  la substance mucoidr d e  la crete du coq. C. R. Soc. Biol., 106: 804405. BOAS, N. F. (1949).-Isolation of hyaluronic acid from the cock's comb. J. Biol. Chem., 181: 573-575. CE\JALLOS BoHORQUU, C. (1972).-Estudio s t~uctural  y ultraestructural de los apkndices cefáiicns d e  las aves, cresta, barbilla y orejuelas del Gnllris gnllrts L. Madrid, Servicio d e  Publicaciones, Fac~dtad  de Ciriicias Universidad Copliitense d e  Madrid. 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Estudio histoquímico de la cresta, barbillas y rejuelas de Gallus domesticus L

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