FARINAS, C. S.

MATTOSO, L. H. C.

MOMESSO, M.

ROJAS, M. J.

Portuguese

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

   IX Workshop de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio   Embrapa Instrumentação, São Carlos/SP, 21 a 22 de Novembro de 2017 227  IMOBILIZAÇÃO DE FITASE EM NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA  Mayerlenis J. Rojas1, Marina Momesso1,2, Luiz H. C. Mattoso1, Cristiane S. Farinas1  1Embrapa Instrumentação, Laboratório Nacional de Nanotecnologia para o Agronegócio, São Carlos, SP,  2Universidade Federal de Alfenas, Alfenas, MG  mayerlenis@gmail.com  Classificação: Processos de imobilização de biomoléculas e funcionalização em nanopartículas  Resumo O objetivo deste trabalho foi estudar a imobilização da enzima fitase usando nanopartículas de quitosana.  As nanopartículas de quitosana produzidas por aspersão em um sistema de fiação por sopro foram utilizadas para imobilizar a fitase mediante três métodos: adsorção, adsorção seguida por entrecruzamento com amido-aldeído e entrecruzamento simultâneo entre enzima-amido e quitosana. Os três métodos se mostraram altamente eficientes apresentando rendimentos superiores a 92%. Dentre os métodos estudados a adsorção seguida por entrecruzamento com amido-aldeído rendeu o derivado mais ativo apresentando 90,8% de atividade recuperada. Estes resultados indicam possíveis aplicações deste biocatalisador na indústria de rações animais.   Palavras-chave: Quitosana; Nanopartículas; Fitase, Imobilização   PHYTASE IMMOBILIZATION ON CHITOSAN NANOPARTICLES  Abstract The aim of this work was to study the immobilization of phytase on chitosan nanoparticles. Chitosan nanoparticles produced by spraying in a solution blow spinning system were used to immobilize phytase by three methods: adsorption, adsorption followed by cross-linking with aldehyde-starch (DAS) and simultaneous cross-linking between enzyme-DAS and chitosan. The three methods were highly efficient with yields higher than 92%. Among the studied methods the adsorption followed by cross-linking with DAS yielded the most active derivative, which showed 90.8% of activity recovery. These results indicate possible applications of this biocatalyst in the animal feed industry.  Keywords: Chitosan; Nanoparticles; Phytase; Immobilization.   1 INTRODUÇÃO  O fitato é a principal forma de armazenamento do fósforo nos cereais e leguminosas, constituindo entre 60-90% do teor total de fósforo nas plantas. A alimentação animal é principalmente de origem vegetal (sementes oleaginosas, grãos de cereais e leguminosas) e, por conseguinte, contêm muito fitato (Reddy, 1982). No entanto, estima-se que cerca de dois terços deste fósforo é pouco digerido pelos organismos monogástricos, já que estes não produzem quantidades suficientes da enzima fitase para hidrolisar o fitato (Bedford 2000). Consequentemente, fontes de fósforos inorgânicas são usualmente adicionadas às rações animais.  Embora a suplementação de fósforo inorgânico nas rações animais aumente a sua disponibilidade, a grande maioria do fósforo que não é assimilado pelos organismos termina no meio ambiente mediante a secreção das fezes, causando problemas de contaminação e poluição. Assim, a degradação do fitato por enzimas exógenas aumentaria a disponibilização do fósforo e mineriais nos animais e reduziria o impacto ambiental causado pelas elevadas cargas de fósforo nos efluentes agrícolas (Kumar et al    IX Workshop de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio   Embrapa Instrumentação, São Carlos/SP, 21 a 22 de Novembro de 2017 228 2016). Contudo, a fragilidade operacional destas enzimas em condições extremas de pH e temperatura são as principais limitações do uso das fitases nas rações animais.   Uma alternativa para contornar esses inconvenientes consiste na imobilização de enzimas usando suportes sólidos. Recentemente, a imobilização de enzimas em nanopartículas vem ganhando cada vez mais interesse devido à grande área superficial destes materiais, a qual permite imobilizar maior quantidade de enzima por unidade de massa (Greiner et al, 2013). Entre os materiais mais amplamente utilizados, destaca-se a quitosana por ter muitas propriedades biológicas tais como: não toxicidade, biodegradabilidade e biocompatibilidade (Lee et al, 1995). Neste contexto, este trabalho tem por objetivo desenvolver um biocatalisador não tóxico com possíveis aplicações para rações animais mediante a imobilização da enzima fitase em nanopartículas de quitosana.   2 MATERIAL E MÉTODOS  2.1 Materiais  A enzima Fitase (Smizyme Phytase 5000) utilizada foi produzida pela Beijing Smile feed Sci (China). Quitosana foi adquirida da Polymar (Fortaleza, Brasil), ácido fítico da marca Sigma-Aldrich SA (St. Louis, MO, EUA). Amido sóluvel, molibdato de amónio e ácido tricloroacético foram adquiridos da Synth (Brasil). Outros reagentes de grau analítico.  2.2 Métodos  Preparação das nanopartículas de quitosana. As nanopartículas foram preparadas por aspersão usando um sistema de fiação por sopro. Uma solução de quitosana (10 g/L) em ácido acético 2% (v/v) foi transferida a uma seringa de vidro e ejetada a uma vazão de 0.1 ml/min usando uma bomba de infusão (New Era, modelo NE-300). A solução foi aspergida usando ar comprimido a 2 Psi e coletada em 50 mL de uma solução de tripolifosfato de sódio (0,1 g/L) sobre agitação magnética.  As nanopartículas foram centrifugadas por 15 min a 8000 rpm e resuspendidas em agua destilada para posterior uso.   Imobilização de Fitase. As nanopartículas de quitosana (200 mg) foram subersas em 5 mL de uma solução enzimática preparada em tampão fosfato de sódio (pH 7, 5mM), contendo uma carga enzimática de 10 mg de proteína/g suporte. A suspensão (solução enzimática + suporte) e o branco reacional (solução enzimática sem suporte) foram mantidos sob agitação a 25ºC. A imobilização da fitase nas nanopartículas de quitosana foi realizada por 3 métodos: adsorção (realizada por um tempo de 24 h), adsorção (22 h, pH 7, 5mM) seguida por entrecruzamento com amido-aldeído (3 h, pH 7, 5mM) e entrecruzamento simultaneo (quitosana-fitase e amido-aldeído) por 24 h. As etapas de entrecruzamento foram realizadas adicionando 250 µL de uma solução de amido-aldeído (30 g/L) ao início da imobilização (no caso do entrecruzamento simultâneo) ou após 22 h de adsorção para o caso da adsorção seguida por entrecruzamento. Após o período de imobilização os derivados (enzima imobilizada) foram lavados 2 vezes com tampão fosfato (pH 7, 5mM), centrifugados e resuspendidos em 5 ml de tampão acetato (100 mM, pH 5,5). O parâmetros da imobilização, rendimento e atividade recuperada, foram calculadas usando as equações (1) e (2) respectivamente:    (1)              (2)      (3)  Onde  é o rendimento da imobilização,  é a atividade recuperada,  é a atividade da enzima não imobilizada ao final do processo de imobilização,  é a atividade do derivado (enzima imobilizada),  é a atividade inicial oferecida para a imobilização.    IX Workshop de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio   Embrapa Instrumentação, São Carlos/SP, 21 a 22 de Novembro de 2017 229 Determinação da atividade enzimática da fitase. A atividade da fitase foi determinada quantificando-se a liberação de fosfato em um período de 15 min de hidrólise de ácido fítico catalisada pela enzima. A concentração de fosfato liberado foi medida empregando o método descrito por Harlan e Harlan (1980). O substrato na concentração de 2.5 mM era diluído em tampão acetato (50 mM, pH 5.5 ), a esta solução eram adicionados determinados volumes de solução enzimática livre ou  derivado (resuspendido em tampão), a mistura resultante era incubada a 37°C por 15 min sob agitação. Após o periodo de reação, era retirada uma alíquota de 400 μL do meio reacional e a reação era interrompida adicionando 200 µL de acido tricloroacetico 10% m/v. Em seguida, foram adicionados  200 µL de agua destilada e 500 µL do reagente Taussky Schoor. As absorbâncias foram medidas a 660 nm, contra um branco contendo 0,4 mL de substrato (fitato de sódio em tampão acetato) sem a presença da enzima. A quantificação do fosfato liberado foi realizada usando uma curva padrão de KH2PO4. Uma unidade de atividade  fitasica (FTU) foi definida como a quantidade de fitase requerida para liberar 1μmol de fósforo em 1 min nas condições de ensaio (pH 5,5; 37°C).  3 RESULTADOS E DISCUSSÃO  A Figura 1a apresenta a morfologia e o tamanho das nanopartículas de quitosana.Nota-se que a grande maioria das nanopartículas apresentou formas esféricas com pequenas porosidades e tamanhos de partícula com diâmetros menores que 100 nm. As nanopartículas de quitosana usadas para a adsorção da fitase (Fig. 1b) não apresentaram cavidades, mostrando que estes espaços vazios foram ocupados provavelmente pelas moleculas de enzimas. Observa-se também que o entrecruzamento simultâneo das enzimas com as particulas de quitosana utilizando amido-aldeído, além de formar ligações covalentes entre os grupos aldeídos do amido-aldeído e os grupos aminos da quitosana também levou a uma macro-reticulação entre as nanopartículas de quitosana e enzima, formando derivados de maior tamanho.   Figura 1. Imagens de microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo (FEG) das particulas de quitosana (a), enzima adsorvida nas nanopartículas (b), enzima imobilizada por entrecruzamento simultáneo com amido-aldeído (c).       Na presença de polieletrólitos aniônicos, tais como o tripolifosfato de sódio, a quitosana forma esferas compostas em sua superfície por grupos hidroxilas e aminas, que as tornam interessantes para a imobilização de enzimas (Viera et al, 2013).  A Tabela 1 mostra os resultados dos parâmetros avaliados na imobilização da fitase usando nanopartículas de quitosana. Observa-se que a adsorção da fitase nas nanopartículas seguidas por entrecruzamento com amido-aldeído apresentou a máxima atividade recuperada (90,8 %), provavelmente a adição do amido aldeído após as 22 h favoreceu o acoplamento da enzima adsorvida à quitosana mediante ligações covalentes. Por outro lado, longos periodos de  entrecruzamento simultaneo (24 h) entre a enzima e o suporte levaram à distorção da estrutura da enzima por entrecruzamento excessivo, rendendo derivados com a menor atividade recuperada (72 %).      a) b) c)    IX Workshop de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio   Embrapa Instrumentação, São Carlos/SP, 21 a 22 de Novembro de 2017 230 Tabela 1. Parámetros da imobilização da fitase em nanopartículas de quitosana Método de imobilização Rendimento (%) Atividade Recuperada (%) Adsorção 92,1 81,8 Adsorção(pH 7, 5mM, 22h) seguida por ligação covalente (pH 7, 5mM, 3h) 99,2 90,8 Entrecruzamento simultaneo  (pH 7, 5mM, 24h) 99,7 72,6   4 CONCLUSÃO  Neste trabalho mostrou-se que as  nanopartículas de quitosana preparadas por aspersão em sistemas de fiação por sopro apresentaram resultados promissores na utilização como suporte para a imobilização de fitase por adsorção física, adsorção e reticulação com amido e entrecruzamento simultâneo. Este biocatalisador (de baixa citoxicidade) apresenta um grande potencial de aplicação para ser suplementado nas rações animais.     AGRADECIMENTOS  Os autores agradecem a Embrapa, MCTI/SISNANO, CNPq, FAPESP e CAPES pelo apoio financeiro.    REFERÊNCIAS  Bedford, M. R. Exogenous enzymes in monogastric nutrition - their current value and future benefits. Animal Feed Science and Technology, v. 86, p. 1-13, 2000.  Greiner et al. Production of partially phosphorylated myo-inositol phosphates using phytases immobilised on magnetic nanoparticles. Bioresource Technology, v. 142, p. 375–383, 2013.  Harland, B.F. and J. Harland. Fermentative reduction of phytic acid in rye, wheat and whole wheat bread. Cereal Chem., v. 57, p.226-229, 1980.   Kumar A., Chanderman A. and Singh S. Microbial production of phytases for combating environmental phosphate pollution and other diverse applications. Journal Critical Reviews in Environmental Science and Technology, v. 46, 2016.  Lee, K.Y., Ha, S.W., Park, W.H. Blood biocompatibility and biodegradability of partially N-acylated chitosan derivatives. Biomaterials v.16, p.1211–1216, 1995.  Reddy, N. R., S. K. Sathe, and D. K. Salunkhe Phytates in legumes and cereals. Advances in Food Research, v. 28, p. 1- 92, 1982.  Vieira et al. Hydrolysis of lactose in whole milk catalyzed by B-galactosidase from Kluyveromyces fragilis immobilized on chitosan-based matrix. Biochemical Engineering Journal, v. 81, p. 54- 64, 2013. 

Imobilização de fitase em nanopartículas de quitosana.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/1081280/1/PImobilizacaodeFitaseemNanoparticulas....pdf

Imobilização de fitase em nanopartículas de quitosana.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa