ARANTES, A. F. B.

ARAUJO, A. C. B. de

BRUNALE, P. P. de B.

COSTA, P. P. K. G.

FAVARO, L. C. de L.

FRANCO, P. F.

JARAMILLO, P. M. D.

MORAES, B. R. de L.

QUIRINO, B. F.

SOARES, I. P.

SOUTO, B. de M.

TAMIETTI, M. S.

Portuguese

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IV Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais 10Graduandos Contaminação microbiana de biodiesel (B100), diesel (B0), e blendas (B7) comercializadas no Estado de Goiás e no Distrito FederalArtur Fiuza Borges Arantes1, Mariana Santos Tamietti2, Ana Carolina Bitencourt de Araujo3, Patrícia Portela de Medeiros Brunale 4, Bruno Rafael de Lima Moraes 5, Paula Fernandes Franco6, Patrícia Pinto Kalil Gonçalves Costa7, Paula Marcela Duque Jaramillo8, Betania Ferraz Quirino 9, Betulia de Moraes Souto10, Itânia Pinheiro Soares 11, Léia Cecilia de Lima Fávaro12 Resumo No Brasil, atualmente, o monitoramento da qualidade do biodiesel, por meio de ensaios físico-químicos, é feito apenas na usina e nos postos de combustíveis, quando em mistura com o diesel. Apesar do conhecimento dos efeitos deletérios da ação microbiana nos combustíveis líquidos, não há no momento legislação específica nacional que regule a avaliação da presença de microrganismos contaminantes em combustíveis líquidos e sistemas associados. Nesse contexto, buscou-se determinar as comunidades microbianas cultiváveis contaminantes em amostras representativas de diesel (B0, uma amostra S500 obtida de distribuidora no DF), de biodiesel (B100, duas amostras obtidas de tanques de armazenamento de usina de produção em Goiás e uma de distribuidora no DF), bem como de blendas biodiesel/diesel (B7, com duas amostras de S500 e duas de S10 obtidas de diferentes postos de gasolina no DF). Todas as amostras foram processadas imediatamente após a coleta para o isolamento de microrganismos. Na sequência, duas amostras de diesel (B0 S500 de distribuidora do DF e blenda B7 S500 de posto de combustível do DF) foram coletadas e submetidas à simulação de estocagem em protótipos de tanques de 20 litros, com isolamentos de microrganismos realizados aos 0, 30, 60 e 90 dias de armazenamento. Cada amostra 1 Graduando em Ciências Farmacêuticas, Universidade de Brasília, artur.arantes@colaborador.embrapa.br 2 Bióloga, mestranda em Biologia Molecular na Universidade de Brasília, mariana.tamietti@colaborador.embrapa.br 3 Bióloga, mestre em Ciências Genômicas, Universidade Católica de Brasilia, anaraujo.df@gmail.com 4 Química, mestre em Tecnologias Química e Biológica, Universidade de Brasilia, patybrunale@globo.com 5 Biólogo, graduado em Ciências Biológicas, Universidade Católica de Brasília, bruno.moraes@colaborador.embrapa.br 6 Bióloga, mestre em Biologia Molecular na Universidade de Brasília, analista da Embrapa Agroenergia, paula.franco@embrapa.br 7 Química, mestre em Química, analista da Embrapa Agroenergia, patricia.costa@embrapa.br 8 Biomédica, doutora em Biologia Molecular, Universidade de Brasilia, Paula.jaramillo@colaborador.embrapa.br 9 Bióloga, doutora em Genética e Melhoramento de Plantas, pesquisadora da Embrapa Agroenergia, betania.quirino@embrapa.br 10 Bióloga, doutora em Genética e Melhoramento de Plantas, analista da Embrapa Agroenergia, betulia.souto@embrapa.br 11 Química, doutora em Química, pesquisadora da Embrapa Agroenergia, itania.soares@embrapa.br 12 Bióloga, doutora em Genética e Melhoramento de Plantas, pesquisadora da Embrapa Agroenergia, leia.favaro@embrapa.br IV Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais 11Graduandos foi filtrada (volumes de 2 mL, 20 mL e 200 mL) em membrana de 0,22 micrômetros (três membranas para cada volume), e alíquotas foram dispostas em meios de cultura TSA, MEA, e YPDA contendo fungicida ou antibióticos, para o isolamento de bactérias, fungos filamentosos e leveduriformes, respectivamente. Isolaram-se bactérias e fungos de todas as amostras avaliadas, constituindo-se um banco de microrganismos contaminantes de biodiesel/diesel com mais de 700 linhagens preservadas. Análise das sequências do DNA ribossômico revelou que as bactérias identificadas até o momento pertencem aos gêneros Bacillus, Janibacter, Lysinibacillus e Paenibacillus. Já os fungos pertencem aos gêneros Aspergillus, Byssochlamys e Paecilomyces. O conhecimento da diversidade microbiana de combustíveis é importante para melhor compreensão do papel e do impacto desses microrganismos contaminantes na qualidade do combustível armazenado. Palavras-chave: fungos filamentosos. bactérias. biocombustíveis. isolamento microbiano. DNA ribosomal. Introdução É sabido que o biodiesel pode sofrer degradação química, a qual pode ser potencializada por fatores como temperatura, luz e umidade. Além disso, o biodiesel também pode sofrer degradação mediada por microrganismos, que têm seu crescimento estimulado pela presença de água livre e outros micronutrientes (CHAO et al., 2010). De fato, as temperaturas elevadas que ocorrem durante os processos de produção dos combustíveis esterilizam o combustível produzido. No entanto, durante o armazenamento, ou dependendo das condições de transporte, pode ocorrer a entrada de água nos sistemas e, por conseguinte, a contaminação microbiológica e uma possível biodeterioração. A água é um fator essencial para a atividade microbiana e, devido a esse, fato a maioria das recomendações para evitar a presença e a atividade de microrganismos envolve o controle da água nos sistemas (PASMAN, 2013; SOARES et al., 2014). Apesar do conhecimento dos efeitos deletérios da ação microbiana nos combustíveis líquidos, especialmente diesel e biodiesel, não há no momento legislação específica no Brasil que regule a avaliação de contaminação microbiológica em combustíveis líquidos e sistemas associados. Nesse contexto, buscou-se acessar as comunidades microbianas cultiváveis contaminantes de diesel, biodiesel e blendas biodiesel/diesel, utilizando-se amostras coletadas no Estado de Goiás e no Distrito Federal. Materiais e métodos Coleta de amostras de combustível A coleta foi realizada em bombonas estéreis, com auxílio de luvas e utensílios esterilizados, conforme recomendações da norma internacional ASTM D6469-16 (ASTM D6974-16 Standard Practice for Enumeration of Viable Bacteria and Fungi in Liquid Fuels—Filtration and Culture Procedures). Os combustíveis coletados foram representativos de diferentes pontos da cadeia de produção e distribuição dos IV Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais 12Graduandos combustíveis. Oito amostras foram processadas para análise microbiológica imediatamente após a coleta, enquanto duas amostras foram coletadas e armazenadas em protótipos de tanques de estocagem para amostragens ao longo do tempo. As amostras que foram processadas para isolamento microbiano imediatamente após a coleta foram: a) biodiesel (B100), sendo duas amostras de tanques de armazenamento de usina de produção no Estado de Goiás e uma amostra de tanque de armazenamento de uma distribuidora no DF; b) diesel (B0), sendo uma amostra (S500) obtida de distribuidora no DF; c) blendas de diesel B7, sendo duas amostras de S500 e duas amostras de S10 obtidas de diferentes postos de gasolina no DF. Amostras de diesel (B0 S500 de distribuidora do DF e blenda B7 S500 de posto de combustível do DF) foram coletadas e submetidas à simulação de estocagem em protótipos de tanques de 10 litros. Isolamentos de microrganismos foram realizados nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de armazenamento. Isolamento de microrganismos contaminantes de biodiesel, diesel e blendas Para o isolamento, cada amostra foi filtrada (2 mL, 20 mL e 200 mL) em membrana de 0,22 micrômetros (três membranas para cada volume), a qual foi disposta em meios de cultura TSA, MEA, e YPDA contendo fungicida ou antibióticos, para o isolamento de bactérias, fungos filamentosos e leveduriformes, respectivamente (ASTM D6469). As placas foram incubadas a 28 °C e monitoradas por até 30 dias quanto ao crescimento de microrganismos. O número de microrganismos foi contado e as colônias foram purificadas até a obtenção de culturas puras. As bactérias foram preservadas por ultracongelamento e os fungos foram preservados pelo método Castellani (1967).Identificação molecular de bactérias e fungos contaminantes de biodiesel, diesel e blendas As bactérias e fungos foram cultivados e submetidos à extração de ácidos nucléicos. Para bactérias, a região 16S do DNA ribossômico foi amplificada com os iniciadores universais P0(27f) (5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) e R1378 (5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’) (LANE, 1999), os quais amplificam uma região de aproximadamente 1.500 pares de bases. Para os fungos, a região ITS1-5.8S-ITS2 do DNA ribossômico foi amplificada com os primers ITS1 (5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’), os quais amplificam uma região de aproximadamente 600 pb (FAVARO et al., 2011). Os produtos de amplificação foramseparados em gel de agarose (1%), corados com brometo de etídio e fotodocumentados sob luz UV. Os produtos de amplificação foram purificados e o sequenciamento foi realizado para ambas as fitas com os mesmos iniciadores descritos. As sequências foram analisadas com auxílio do software CodonCode Aligner13 para análise de qualidade e obtenção da sequência consenso. As sequências foram analisadas com o auxílio da ferramenta BLAST nas bases de dados de microrganismos: MycoBank, Ribosomal Database Project e GenBank14. 12Disponível em: <http://www.codoncode.com/>Disponível em: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiIV Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais   13Graduandos Resultados e Discussão Os  resultados  de  isolamento  de  combustível  não  armazenado  estão representados na Tabela 1. Na Tabela 2, estão representados os dados de isolamento de amostras armazenadas por até 90 dias. Isolaram‐se fungos e bactérias de todas as amostras e tipos de combustíveis. Uma coleção de microrganismos contaminantes foi estabelecida  e  encontra‐se  armazenada  na  Embrapa  Agroenergia.  Sua  identificação parcial  revela  que  as  bactérias  pertencem  aos  gêneros  Bacillus,  Janibacter, Lysinibacillus  e  Paenibacillus,  e  que  os  fungos  pertencem  aos  gêneros  Aspergillus, Byssochlamys e Paecilomyces. Gassen et al.  (2015)  identificaram Aspergillus e Paecilomyces em amostras de biodiesel, diesel e blendas biodiesel/diesel. Esses microrganismos seriam responsáveis por maior deterioração de  amostras  contendo biodiesel  comaparado  a  amostras de diesel puro. Tabela  1.  Número  de microrganismos  cultiváveis  isolados  a  partir  de  amostras  de combustíveis provenientes de diferentes pontos da cadeia produtiva, no ano de 2015. Para essas amostras, as análises foram realizadas imediatamente após a coleta (tempo zero). Nº  Amostra  Origem Linhagens obtidas e purificadas (fungos/bactérias) Linhagens preservadas (fungos/bactérias) 1  ANP  S500/B7/Coleta  22‐01‐2015/Posto B/Asa Norte DF  14/14  14/14 2  ANP  S500/B7/Coleta  22‐01‐2015/Posto C/Asa Norte DF  6/46  6/46 3  ANP  S10/B7/Coleta  22‐01‐2015/Posto A/Asa Norte DF  8/21  8/21 4  ANP  S10/B7/Coleta  22‐01‐2015/Posto C/Asa Norte DF  7/10  7/10 5  ANP B100/Coleta 05‐14/Goiás  GO  13/4  13/4 6  B100 / Coleta 16‐06‐15 /  (B100 Metílico) GO  9/51  8/45 (*) 7  B100  /  Distribuidora  /  Coleta 03‐07‐2015 (LGB‐024/2015) DF  26/17  23/16 (*) 8  Diesel S500 / Distribuidora /  DF  43/30  39/30 (*) (*) Alguns microrganismos não permaneceram viáveis após a preservação. Dentre  as  amostras  apresentadas  na  Tabela  1,  observou‐se  uma  grande variação nas quantidades de  fungos e bactérias em amostras de  coletas nos postos, nas quais não se pode aferir se a concentração de enxofre (S500 e S10) no combustível afetou diretamente o crescimento dos microrganismos. Observou‐se que as amostras de B100 e diesel da distribuidora (6, 7 e 8) apresentaram quantias consideráveis tanto de  fungos  quanto  de  bactérias.  Nos  tanques  das  distribuidoras,  existe  um  grande volume  de  combustível  que  pode  ser  proveniente  de  diversos  lotes  e  diferentes origens e  composições,  como no  caso do biodiesel. Esse  fato pode explicar  a maior concentração de microrganismos. Observou‐se ainda que em quase todas as amostras não houve redução entre as linhagens purificadas e preservadas.   IV Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais   14Graduandos Tabela  2.  Número  de microrganismos  cultiváveis  isolados  a  partir  de  amostras  de combustíveis provenientes de diferentes pontos da cadeia produtiva, no ano de 2015. Para essas amostras, as análises foram realizadas em diferentes tempos de estocagem. Amostra  Origem Linhagens obtidas, purificadas e preservadas (fungos/bactérias) Tempo zero lavagem do tanque (Fungo/ Bactéria) Tempo zero (Fungo/ Bactéria) Tempo 30D (Fungo/ Bactéria) Tempo 60D (Fungo/ Bactéria) Tempo 90D (Fungo/ Bactéria) Diesel S500 / Distribuidora / Linha de bombeamento. Coleta 03‐07‐2015 (LGB‐025/2015) DF  13/27  22/10  16/6  13/40  68/20 B7 (S500) Posto / Coleta 17‐08‐2015 (LGB‐034/2015) DF  35/45  19/26  50/8  9/4  103/29     Na Tabela 2, observamos que foram idenficados fungos e bactérias na lavagem do tanque, durante a esterilização para receber o combustível. Em relação à amostra S500, houve uma redução da presença de fungos entre os tempos Zero e 60 dias, com aumento não esperado, superior a cinco vezes aos 90 dias. Com as bactérias, houve um decréscimo em sua contagem, com aumento aos 60 dias, seguido de nova redução aos  90  dias.  Para  a  amostra  B7,  houve  uma  significativa  oscilação  na  contagem  de fungos,  uma  expressiva  redução  na  contagem  de  bactérias  e  um  crescimento inesperado de ambos para o tempo de 90 dias.  Não  fosse  o  comportamento  observado  aos  90  dias,  poderia  inferir‐se  que  nas condições  avaliadas,  a  amostra  que  contém  biodiesel  estaria  com  menor  grau  de contaminação por microrganismos, muito embora isso não reflita necessariamente em degradação do combustível. Conclusões Com análises apenas no tempo zero, podemos inferir que a contaminação está mais  relacionada  às  condições  de  armazenamento  da  amostra  que  propriamente  à composição  desta.  Em  relação  à  estococagem  por  perído  de  até  90  dias,  serão necessários mais testes que possam explicar as oscilações observadas. Agradecimentos Embrapa e CNPq. IV Encontro de Pesquisa e Inovação da Embrapa Agroenergia: Anais   15Graduandos Referências CASTELLANI,  A.  Maintenance  and  cultivation  of  common  pathogenic  fungi  in  distilled  water:  Further researches. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 70, n. 8, p. 181‐184, 1967. CHAO, Y.;  LIU, N.;  ZHANG, T.; CHEN,  S.  Isolation  and  characterization of bacteria  from engine  sludge generated from biodiesel‐diesel blends. Fuel, v. 89, n. 11, p. 3358‐3364, 2010. FAVARO,  L.  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Contaminação microbiana de biodiesel (B100), diesel (B0), e blendas (B7) comercializadas no Estado de Goiás e no Distrito Federal.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/1075757/1/PaginasdeAnaisIVEnPI11116.pdf

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