CAMARGO, G.

COTRIM, G.

DIAS, W. P.

HOFFMANN-CAMPO, C. B.

LOPES, I. de O. N.

MIYASAKI, A. K.

NUNES, E. de O.

SCUPINARI, T.

Portuguese

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Potencial de extrato de flores de Crotalaria no controle de nematoides da sojaCAMARGO, G.1; MIYASAKI, A.K.2; COTRIM, G.2; SCUPINARI, T. 3; HOFFMANN-CAMPO, C.B.4; DIAS, W.P.4, LOPES, I.O.N.4; NUNES, E.O.4 1Universidade Pitágoras Unopar, Bolsista PIBIC/CNPq; 2Centro Universitário Filadélfia – Unifil; 3Universidade Estadual de Londrina; 4Embrapa SojaIntroduçãoEm razão da importância da soja frente às necessidades alimentares mundiais, aumento da demanda por commodities agrícolas e ao limita-do potencial de expansão das terras aráveis, o aumento da produção mundial tem se dado pela combinação da expansão de área de produ-ção e do maior rendimento. No entanto, quando cultivares adaptadas são adotadas pelo produtor, a incapacidade de alcançar o rendimento ideal é associada às condições de estresse ambiental por fatores bióti-cos e/ou abióticos (BOARD; KAHLON, 2011).Dentre os fatores bióticos, as patologias são responsáveis por grandes perdas na cultura da soja no Brasil e um importante grupo de patóge-nos que reduzem a produtividade são os fitonematoides (ALMEIDA et 166 XII Jornada Acadêmica da Embrapa Sojaal., 2005). Esses organismos exercem determinados graus de parasitis-mo que afetam o desenvolvimento do sistema radicular, com redução da absorção de água e nutrientes, e consequente ocorrência de sub-desenvolvimento vegetal (CADET; SPAULL, 2005; TIHOHOD, 2000). Mais de 100 espécies de nematoides estão associadas à cultura da soja no mundo (DIAS et al., 2010), algumas delas têm causado per-das consideráveis na cultura da soja, com a necessidade de manejos diversificados. Segundo Ferraz (2001) e Juhász et al. (2013), no Brasil as espécies que causam maiores danos a essa cultura são Meloidogyne javanica, Meloidogyne incognita Heterodera glycines e Pratylenchus brachyurus. Recentemente, o nematoide Aphelenchoides sp. foi relata-do como agente causal da soja louca II (FAVORETO et al., 2015).As plantas do gênero Crotalaria são empregadas na rotação de culturas por possuírem raízes profundas e robustas (auxiliam na descompacta-ção pela formação de bioporos) que melhoram a infiltração de água no perfil do solo e por aumentarem a disponibilidade de N e P no sistema (CALEGARI; COSTA, 2009). O estudo de técnicas alternativas, como a adubação verde, para controlar fitonematoides é de extrema importân-cia (MORAES et al., 2006). Plantas de Crotalaria no manejo, em siste-mas conservacionistas, exercem efeitos antagônicos e/ou nematostáti-cos pela liberação de compostos secundários no ambiente (RITZINGER; FANCELLI, 2006). A supressão de nematoides foi evidenciada por Cale-gari et al. (1993), onde C. spectabilis e C. ochroleuca demonstraram serem efetivas no impedimento da multiplicação de populações juvenis, sugerindo que esse fenômeno está relacionado ao metabólito secundá-rio monocrotalina (WANG et al., 2002). No entanto, existem evidên-cias de que a toxidez também pode estar relacionada a outras classes de compostos bioativos ou da interação entre classes de metabólitos secundários (ALMEIDA et al., 2008; GARRIDO et al., 2008). Portanto, o emprego da ecologia química no estudo de metabólitos se-cundários de plantas, a fim de dispor de diferentes recursos para o con-trole de fitonematoides (alternativos aos nematicidas sintéticos), pode contribuir para a manutenção da competitividade da cultura da soja. O 167XII Jornada Acadêmica da Embrapa Sojapresente estudo objetivou avaliar o efeito nematicida e/ou nematostá-tico de extrato de flores de C. spectabilis sobre formas juvenis (J2) de nematoides que afetam a cultura da soja.Material e MétodosObtenção do extrato vegetalCultivo e preparo do material vegetal:  Crotalaria spectabilis foi escolhida por ser uma cultura supressora de nematoides muito utilizada no sistema de rotação de culturas da soja.  A semeadura foi efetuada a lanço em 26/02/2016, em uma área de 325 m2, latossolo vermelho-amarelo e textura arenosa (infestada de M. incognita e P. brachyurus) na área experimental Estância Água Rica (22º39`23`` e 50º20`51``) em Assis, SP. A parte da planta de in-teresse foram as flores, colhidas 146 dias após a semeadura (início do período de florescimento). A colheita foi manual e no período matutino e, as flores acondicionadas em embalagens plásticas (não vedadas, para minimizar o efeito da evapotranspiração) e imediatamente trans-portadas ao laboratório para separação das flores do caule e do pecíolo. As amostras foram secas em estufa (40 °C), trituradas em triturador FAK-CLASSE I–IPX1 até obtenção de pó fino, pesadas em alíquotas de 50 g e armazenadas em freezer (-13 ºC) até o momento da extração.Extrato: Foi utilizado o processo de turbo-extração a frio, seguido de macera-ção por oito dias (ao abrigo da luz) a temperatura ambiente; EtOH:H2O (80:20 v/v) foi utilizado como solvente extrator. A proporção de bio-massa seca de flores utilizada foi de 5% (m/v). O extrato foi filtrado em flitro Whatmann (= 240 mm) e submetido a rotaevaporação (Rotavapor R124-BÜCHI®) em banho ultratermostático a 43 °C para evaporação da fração alcoó-lica do solvente e mantido sob refrigeração (4 °C), ao abrigo da luz até a realização dos bioensaios.168 XII Jornada Acadêmica da Embrapa SojaObtenção dos organismos-teste:Grupo de nematoides-teste:P. brachyurus, M. javanica, H. glycines e Aphelechoides besseyi. O mé-todo de Favoreto et al. (2011) foi usado para o Aphelechoides, sendo  foi multiplicado em colônias de Fusarium sp. cultivado em meio PDA (ágar batata dextrose). Os demais fitonematoides foram multiplicadas em casa de vegetação nas cultivares suscetíveis. Os J2 de todos os nematoides foram extraídos no Laboratório de Nematologia da Embrapa Soja, Londrina, PR.Obtenção dos ovos dos nematoides: Os ovos foram obtidos a partir de populações puras de cada espécie, multiplicadas, em casa de vegetação, isoladamente em plantas de soja suscetíveis. Os métodos foram: Bonetti e Ferraz (1981) para Meloido-gyne; Coolen e D`Herdec (1972) para Pratylenchus e Dias et al. (1998) para Heterodera. Obtenção dos juvenis (J2): Os ovos de P. brachyurus, M. javanica e H. glycines obtidos no item 2.2 foram colocados em câmaras de eclosão individualizadas para cada grupo de nematoides, conforme metodologia de Rios (1990). Os J2 de A. besseyi foram obtidos de acordo com o método de Favoreto et al. (2011).Ensaios de suscetibilidade dos grupos de nematoides ao extrato (in vitro):O experimento consistiu em submeter uma suspensão dos J2, obti-dos no item 2.3, ao extrato bruto de flores de C. spectabilis sob cinco diferentes concentrações: 0; 3,1; 6,2; 12,5; 18,8 e 25,0 (mg mL-1) a um volume total de 4 mL (contendo ± 100 J2 mL-1). Para o controle e diluições utilizou-se H2O destilada. Todos os ensaios foram efetuados em três repetições. A quantificação foi efetuada em câmara de Peter’s, considerando a imobilidade dos J2. A avaliação foi efetuada em dois momentos:169XII Jornada Acadêmica da Embrapa SojaExposição: Após 24 h de exposição ao extrato (24 h a.e.) sob incubação a 25 °C e ao abrigo da luz, cada repetição foi quantificada quanto a motilidade, então os nematoides foram lavados em H2O destilada, filtrados em fil-tro de 0,45 μ e ressuspensos em H2O destilada a um volume final de 4 mL. O resultado da exposição foi expresso em porcentagem de juvenis imóveis (efeito nematostático).Recuperação: Após 24 h de incubação em H2O destilada (24 h a.e. + 24 h a.r.), nas mesmas condições descritas no item 3.1, foi efetuada nova quantifi-cação em câmara de Peter’s. Para confirmação da mortalidade foram adicionados 10 μL de solução de corante do Nilo (8%) em cada uma das repetições, após 30 minutos foi realizada a quantificação dos indi-víduos.  Os indivíduos que não apresentaram motilidade e absorveram intensamente o corante foram considerados mortos. O resultado foi expresso em porcentagem de indivíduos mortos (efeito nematicida).Análise estatística:Os dados de imobilidade (24 h a.e) e mortalidade (24 h a.e. + 24 h a.r.) foram analisados por meio do modelo log-logístico de dose-respos-ta com quatro parâmetros, implementado no pacote R drc (RITZ et al., 2015).Resultados e DiscussãoA Figura 1 apresenta os as curvas de resposta das populações de fito-nematoides submetidas ao ensaio de suscetibilidade para cinco diferen-tes concentrações de extrato etanólico bruto de flores de C. spectabi-lis. O tempo de ensaio foi de 48 h e avaliado em dois momentos: após 24 h (a.e) + 24 h (a.r.) e os resultados expressos em % de imobilidade de juvenis (J2). O extrato etanólico de flores demonstrou efeito nematostático e nema-ticida para todos os quatro grupos de nematoides testados. A maior suscetibilidade foi observada para H. glycines com 59,6% (demons-trando suscetibilidade somente a partir de 18,7 mg mL-1), seguido de P. 170 XII Jornada Acadêmica da Embrapa Sojabrachyurus com 51,2% na concentração máxima testada. Esse último nematoide apresentou uma tendência a resistência no ensaio de 24 h a.e., a partir da dose de 6,2 mg mL-1. M. javanica e A. basseyi tiveram as mais altas taxas de recuperação, porém foram os que apresentaram 100% de imobilidade (efeito nematostático) na avaliação 24 h a. e.A concentração letal média (CL50) não pôde ser predita pelo modelo estatístico aqui adotado em função da baixa taxa de mortalidade nas concentrações do extrato aqui utilizadas. Grewal (1989) observou efeito nematicida de extratos (extração aquosa a quente) de flores de 3 espécies de plantas (B. spectabilis, C. cinerarifolium e T. patula) sobre Aphelenchoides composticola. Embora nenhum dos extratos tenha provocado 100% de mortalidade nas concentrações testadas (2-10%, correspondendo a 4-20 mg mL-1), taxas superiores a 50% de morte foram observadas para a dose máxima aplicada (20 mg mL-1), enquanto em nosso estudo foi de 34,0% para  A. besseyi. É importante salientar que embora ambos os estudos tenham tido o mesmo tempo de recu-peração, o tempo de exposição (48 h), foi o dobro do presente estudo (24 h), o nematoide foi do mesmo gênero, mas de espécie diferente e a natureza do solvente extrator também diferente (H2O quente).O corante Azul do Nilo mostrou-se um excelente corante vital aos quatro grupos de nematoides. Ao final de 24 h de incubação o efeito da exposição do nematoide ao extrato bruto foi considerado apenas como nematostático. O efeito nematicida foi considerado somente após a recuperação em água destilada (+2 4h de incubação) e aplicação do corante Azul do Nilo (Figura 2).Devendra et al. (2012) detectaram a presença de duas classes de me-tabólitos secundários (alcaloides e terpenoides) em extratos etanólicos de folhas de C. retusa, C. prostata e C. medicaginea, alguns dos quais têm sido reportados como compostos com ação nematicida. Portanto, em nosso extrato tais compostos podem estar ausentes ou em concen-trações abaixo da sua capacidade deletéria. 171XII Jornada Acadêmica da Embrapa SojaEm um estudo sobre o efeito nematicida de extrato etanólico de semen-tes de C. spectabilis, foi observada mortalidade de 53% do nematoide P. brachyurus, corroborando com o presente trabalho (efetuado nas mesmas condições) que apresentou uma taxa de mortalidade (52,1%) muito próxima na maior dose aplicada (SCUPINARI et al., 2016).ConclusãoQuando se objetiva avaliar o efeito nematicida de extratos, a quantifi-cação só deve ser considerada após o ensaio de recuperação uma vez que os percentuais de recuperação dos nematoides são muito elevados. Extratos etanólicos de partes aéreas de C. spectabilis não apresentaram boa resposta na supressão das quatro populações de nematoides da soja aqui estudados, no entanto, outros solventes extratores deverão ser testados em trabalhos futuros.O corante azul do Nilo apresentou-se como um excelente auxílio na diferenciação entre juvenis vivos e mortos, independente do gênero avaliado.ReferênciasALMEIDA, A.M.R.; FERREIRA, L.P.; YORINORI, J.T.; SILVA, J.F.V.; HENNING, A.A.; GODOY, C.V; COSTAMILAN, L.M.; MEYER, M.C. Doenças da soja. In: KIMATI, H.; AMORIM, L; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIN FILHO, A. e CAMARGO, L.E.A. (Eds.). Manual de Fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. São Paulo: Ceres, 2005. p. 569-588.ALMEIDA, C.D.S.; SOUZA, D.S.L.; SARTO, R.P.; FIRMINO, A.A.P.; SILVA, T.S.; MAGALHÃES, J.C.C.; SÁ, M.F.G.; ROCHA, T.L. Fracionamento de extrato aquoso de sementes de Crotalaria spectabilis efetivo no controle de juvenis de segundo estádio (J2) de Meloidogyne incognita. 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Curvas de resposta (% imobilização) de A. besseyi, H. glycines, M. javanica e P. brachyurus ao extrato etanólico de C. spectabilis [0, 3.1, 6.2, 12.5, 18.7 e 25 mg L-1] após 24h exposição (extrato) e após recuperação (24h extrato + 24h H20 destilada)176 XII Jornada Acadêmica da Embrapa SojaFigura 2. Juvenis (J2) de M. javanica sob microscópio óptico, aumentado de 10x; A0 J2 não corado (vivo) e B) J2 corado (morto), ambos após serem submetidos a coloração com Azul do Nilo (10mg mL-1)

Potencial de extrato de flores de Crotalaria no controle de nematoides da soja.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/1072802/1/165.pdf

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