Mitochondrial disorders are rare diseases but collectively the most frequent group of inborn errors of metabolism. These disorders are genetically and phenotypically heterogenous and can manifest in any organ of the body with onset at any age. Mitochondrial functions are also diverse with the ATP production via the oxidative phosphorylation (OXPHOS) being the most notable. At the center of the OXPHOS machinery is the respiratory complex III (CIII, cytochrome bc1 complex). CIII deficiency in GRACILE syndrome belonging to the Finnish disease heritage causes a neonatal-lethal hepatorenal disease. The primary cause of GRACILE syndrome is a c.A232G (p.S78G) mutation in the BCS1L gene, which encodes a translocase required for Rieske Fe-S protein (RISP, UQCRFS1) incorporation into CIII. Homozygous Bcs1lp.S78G mice bearing the GRACILE syndrome mutation recapitulate the human syndrome, but unlike the patients they have a short asymptomatic period and relatively longer lifespan giving a window for therapeutic interventions. In this thesis project, we studied two potential therapies aiming to improve dysfunctional mitochondria in Bcs1lp.S78G mice: ketogenic diet and NAD+ repletion. We also utilized an alternative oxidase (AOX) transgene to bypass the electron-transfer blockade at CIII.
Ketogenic diets are low-carbohydrate high-fat diets causing nutritional ketosis. They have been proposed to induce a beneficial starvation-like adaptive mitochondrial response involving increased mitochondrial biogenesis. Bcs1lp.S78G mice tolerated the carbohydrate restriction of ketogenic diet, were able to utilize dietary fat as the main energy source and developed ketosis. Ketogenic diet attenuated the hepatic CIII assembly defect, increased CIII activity and corrected mitochondrial structural aberrations. Our results suggested that these changes were not due to increased mitochondrial biogenesis. In line with the improved CIII function, Bcs1l mutant mice showed attenuated hepatopathy as shown by delayed liver fibrosis, inhibited stellate cell activation and hepatic progenitor cell response, decreased cell death and plasma liver enzyme activities. Liver transcriptomics and subsequent histochemical analyses suggested altered macrophage activation and a normalizing effect by ketogenic diet.
In the second study, we characterized NAD+ metabolism in Bcs1lp.S78G mice. We found transcriptionally repressed NAD+ de novo biosynthesis and decreased hepatic NAD+ concentration. Changes in NAD+ consuming processes did not explain the decreased NAD+ levels. Aiming to replete the NAD+ levels, we fed the Bcs1lp.S78G mice a NAD+ precursor nicotinamide riboside (NR). In contrast to previous studies on mitochondrial myopathy models and mouse models with secondary mitochondrial dysfunctions, the hepatic NAD+ depletion of Bcs1lp.S78G mice was refractory to NR supplementation and the disease progression was unaltered. Cellular NAD+ levels regulate mitochondrial functions via sirtuin deacetylases, which are the main targets of NAD+ repletion therapies. Investigation of the upstream effectors of sirtuins showed that a starvation-like metabolic state of Bcs1lp.S78G mice is linked to AMP kinase and cAMP signaling, which likely counterbalances the repressive effect of decreased NAD+ levels on the activity of SIRT1 and SIRT3.
In the third study, we introduced Ciona intestinalis AOX transgene into the Bcs1lp.S78G mice. AOXs are non-mammalian enzymes that can bypass a blockade of the CIII-CIV segment of the respiratory electron transfer. The AOX-expressing Bcs1lp.S78G mice were viable, and their CIII-deficiency stimulated AOX-mediated respiration in isolated mitochondria. AOX expression tripled the median lifespan of Bcs1lp.S78G mice from 200 to 600 days. The extension of the lifespan was predominantly due to the complete prevention of late-onset cardiomyopathy. The effects of AOX were tissue specific. In the heart of Bcs1lp.S78G mice, it preserved normal tissue structure and function, mitochondrial morphology, respiratory electron transfer, and wild-type-like transcriptome. In contrast, AOX only minimally affected the late-stage liver disease. Whereas, in the kidneys, AOX normalized an atrophic kidney phenotype and some histological lesions but it did not normalize kidney function or cause global normalization of transcriptome changes. Our results suggest tissue-specific thresholds of CIII deficiency for in vivo AOX-mediated respiration in CIII deficiency. Moreover, our study demonstrates the value of AOX as a research tool to dissect the pathogenesis of CIII deficiency.
During our investigations, we observed approximately 5-fold difference in the lifespan of the Bcs1lp.S78G mice on two closely related congenic backgrounds. In the fourth study, we tracked the difference to a spontaneous homoplasmic mitochondrial DNA (mtDNA) variant (mt-Cybp.D254N) in an isolated congenic Lund University mouse colony. The variant changes a highly conserved negative amino acid residue in the only mtDNA-encoded subunit of CIII, cytochrome b (MT-CYB). A crossbreeding experiment utilizing the maternal inheritance of mtDNA verified the novel variant as the determinant of the survival difference. Functional studies showed that the variant exacerbated complex III deficiency in all assessed tissues. In otherwise wild-type mice, it also decreased cardiac CIII activity, caused a slight disturbance in mitochondrial bioenergetics, and decreased whole-body energy expenditure. Molecular dynamics simulations and their verification in isolated mutagenized Rhodobacter capsulatus cytochrome bc1 complex showed that the mt-Cybp.D254N variant restricts the mobility of RISP head domain movement.
In summary, these studies provided novel mechanistic and therapeutic insights into CIII deficiency at genetic, molecular, and metabolic level. The results highlight the importance of knowing the underlying tissue-specific pathology and metabolic adaptations when designing therapies for mitochondrial diseases. The genetic epistasis between Bcs1lp.S78G and mt-Cybp.D254N also highlights the role of mitochondrial DNA background as a modifier of mitochondrial disease phenotypes.Mitokondriotaudit ovat harvinaissairauksia, jotka kuitenkin ryhmänä muodostavat yleisimmän synnynnäisten aineenvaihduntahäiriöiden joukon. Mitokondriotautien mutaatioiden ja oireiden kirjo on erittäin laaja. Mitokondriotauti voi ilmetä lähes missä elimessä ja missä iässä tahansa. Mitokondriot ovat soluelimiä, joilla on lukuisia välttämättömiä tehtäviä. Näistä tunnetuin on ATP:n tuotanto oksidatiivisen fosforylaation avulla. Yksi keskeisistä entsyymeistä oksidatiivisessa fosforylaatiossa on hengitysketjun kompleksi III (sytokromi bc1 -kompleksi). Suomalaiseen tautiperintöön kuuluvassa GRACILE-oireyhtymässä kompleksi III:n puutos aiheuttaa vastasyntyneiden kuolemaan johtavan maksa- ja munuaistaudin. Oireyhtymän aiheuttaa homotsygoottinen c.A232G-pistemutaatio (proteiinissa Ser78Gly) BCS1L-geenissä. BCS1L-proteiini on välttämätön Rieske rauta-rikki -proteiinin (RISP, UQCRFS1) kuljetukselle kompleksi III:een. Myös geneettisesti muokatuilla hiirillä homotsygoottinen Bcs1lp.S78G mutaatio aiheuttaa GRACILE-oireyhtymän kaltaisen taudin. Potilaisten poiketen mutanttihiirillä on lyhyt syntymän jälkeinen oireeton jakso ennen taudin puhkeamista, mikä mahdollistaa hoitokokeiden aloittamisen jo ennen taudin puhkeamista. Tämän väitöskirjan tutkimuksissa tutkimme kahta mahdollista hoitoa mitokondrioiden toiminnan kohentamiseksi GRACILE-oireyhtymän hiirimallissa: ketogeenistä ruokavaliota ja solujen NAD+-määrän (nikotiiniamidiadeniinidinukelotidi) lisäämistä. Tutkimme myös kompleksi III:n puutoksen ohittamista vaihtoehtoista oksidaasia (AOX, alternative oxidase) ilmentävän siirtogeenin avulla.
Ketogeeniset ruokavaliot sisältävät erittäin niukasti hiilihydraatteja ja runsaasti rasvaa, mikä aiheuttaa ketoosin eli ketoaineiden lisääntymisen veressä. Ketogeenisen ruokavalion on esitetty käynnistävän osittaisen paastovasteen, johon liittyy mitokondrioiden toiminnan tehostuminen ja niiden lisääntynyt uudistuotanto. Koska Bcs1lp.S78G-mutanttihiiret sopeutuivat ketogeeniseen ruokavalioon, ne ilmeisesti pystyivät hyödyntämään tehokkaasti rasvahappoja ja ketoaineita pääasiallisena energianlähteenä. Ketogeenisellä ruokavaliolla kompleksi III:een sitoutuneen RISP:n määrä lisääntyi mutanttihiiriillä, kuten myös kompleksi III:n aktiivisuus maksan mitokondrioissa. Nämä muutokset näkyivät myös maksan mitokondrioiden rakenteen normalisoitumisena. Tuloksemme viittasivat siihen, että mitokondrioiden toiminnan ja rakenteen parantuminen ei liittynyt lisääntyneeseen mitokondrioiden uudistuotantoon. Ketogeenisen ruokavalio hidasti merkittävästi maksataudin etenemistä, mikä näkyi muun muassa vähentyneenä stellaatti- ja ovaalisolujen aktivoitumisena, sekä vähentyneenä maksan sidekudostumisena. Myös maksaentsyymien aktiivisuudet plasmassa alenivat mutanttihiirillä. Maksan transkriptomiikka ja immunohistokemialliset värjäykset viittasivat siihen, että ketogeeninen ruokavalio vaikutti makrofagien toimintaan.
Väitöskirjan toisessa osatyössä tutkimme Bcs1lp.S78G-hiirten NAD+-aineenvaihduntaa. Havaitsimme, että mutanttihiirillä NAD+-tuotannosta vastaavien geenien ilmentyminen oli vähentynyt kuten myös maksan NAD+-pitoisuus. Muutokset NAD+:tä kuluttavissa aineenvaihduntaprosesseissa eivät selittäneet NAD+-pitoisuuden vähenemää. Syötimme Bcs1lp.S78G-hiirille NAD+:n esiastetta nikotiiniamidiribosidiä (NR) korjataksemme puutoksen. Poiketen aiemmista tutkimuksista, joissa NR:llä on ollut parantava vaikutus mitokondriaalisten lihastautien hiirimalleissa, NR ei vaikuttanut Bcs1lp.S78G-hiirten taudinkuvaan. NR ei myöskään vaikuttanut hoidon päätepisteessä mitattuun maksan NAD+-pitoisuuteen. Solujen NAD+-määrää kohentavien hoitojen yleinen tavoite on tehostaa NAD+:sta riippuvaisten deasetylaasien, sirtuiinien, aktiivisuutta. Tutkimme sirtuiinien NAD+:sta riippumattomia säätelymekanismeja ja havaitsimme, että mutanttihiirten nälkiintymistila aktivoi AMP-kinaasia ja cAMP-signalointia, jotka tunnetusti aktivoivat sirtuiini 1:tä ja 3:sta. Nämä muutokset oletettavasti kompensoivat vähentyneen NAD+-määrän mahdollisia haitallisia vaikutuksia.
Kolmannessa osatyössä siirsimme Ciona intestinalis -vaippaeläimen AOX:ia koodaavan geenin Bcs1lp.S78G-hiiriin. AOX:it ovat nisäkkäiltä puuttuvia mitokondrioiden entsyymejä, jotka voivat ohittaa soluhengityksen tukoksen kompleksi III:n tai IV:n kohdalla. AOX ei ollut haitallinen Bcs1lp.S78G-hiirille ja kompleksi III:n toimintavajaus sai sen aktivoitumaan eristetyissä hiiren mitokondrioissa. Bcs1lp.S78G-hiirille alkoi kehittyä 150 elinpäivän jälkeen sydänlihassairaus, mihin ne kuolivat keskimäärin 200 päivän iässä. AOX:ia ilmentäville mutanttihiirille ei kehittynyt lainkaan sydäntautia, ja niiden mediaanielinikä oli 600 päivää. AOX esti täysin sydäntautiin liittyvän sydämen laajentuman ja toiminnan heikkenemisen. Sydämen mitokondrioissa AOX korjasi soluhengityksen sekä mitokondrioiden rakenteen muutokset. Vastaava pelastavaa vaikutusta AOX:illa ei ollut maksatautiin 150-200 päivän ikäisillä Bcs1lp.S78G-hiirillä. Munuaisissa taas AOX osittain korjasi tai esti kudosrakenteen muutoksia, mutta vaikutti vain vähäisesti tämän elimen toimintaan. Tuloksemme osoittivat, että AOX:n vaikutukset ovat kudoksesta riippuvaisia kompleksi III:n puutoksessa ja että se on hyödyllinen työkaluksi kompleksi III:n tautimekanismien tutkimuksessa.
Tutkimustemme alkuvaiheessa huomasimme noin viisinkertaisen eron Bcs1lp.S78G-hiirten eliniässä kahden eri hiirikannan välillä. Väitöskirjan neljännessä osatyössä löysimme koko genomin sekvensoinnilla homoplasmiseen yhden nukleotidin muutokseen Lundin yliopiston hiirikannan mitokondrio-DNA:ssa. Muutos vaihtaa negatiivisesti varautuneen aspartaatin neutraaliiin asparagiiniin (D254N) sytokromi b -proteiinissa (MT-CYB). MT-CYB on kompleksi III:n alayksiköistä ainoa, jonka geeni sijaitsee mitokondrio-DNA:ssa. Käyttäen hyväksi mitokondrio-DNA:n maternaalista periytymistä osoitimme mt-Cybp.D254N-variantin aiheuttavan Bcs1lp.S78G-hiirten varhaisen kuoleman n. kuukauden iässä. Kuten oletimme mt-Cybp.D254N pahensi Bcs1lp.S78G-hiirten kompleksi III:n puutosta kaikissa tutkimissamme kudoksissa. Yksinäänkin mt-Cybp.D254N vähensi sydämessä kompleksi III:n aktiivisuutta, aiheutti pienen häiriön hengitysketjun toiminnassa ja pienensi hiirten energiankulutusta. Kompleksi III:n rakenteen tietokonemallinnukset ja biofysikaaliset tutkimukset Rhodobacter capsulatus -bakteerin sytokromi bc1-kompleksissa osoittivat, että D254N-aminohappomuutos häiritsee RISP:n elektroneja siirtävän domeenin liikettä kompleksi III:ssa.
Tämän väitöskirjan tutkimukset tuottivat uutta tietoa kompleksi III:n puutoksen tautimekanismeista ja mahdollisista hoidoista. Tuloksemme osoittavat, että on tärkeää tuntea mitokondriotaudin kudoskohtaisia ja vaihtelevia aineenvaihduntamuutoksia suunniteltaessa hoitoja. Bcs1lp.S78G-mutaation ja mt-Cybp.D254N-variantin yhteisvaikutus puolestaan osoitti, että geneettinen tausta voi vaikuttaa odottamattomalla tavalla mitokondriotaudin kulkuun
