Cardiometabolic diseases such as metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) are risk factors for cardiovascular disease and type 2 diabetes. NAFLD can be seen as the hepatic manifestation of the metabolic syndrome and obesity increases the disease risk, but also a genetic component plays a role in the development of NAFLD. The I148M variant of PNPLA3 (PNPLA3-I148M) and E167K variant of TM6SF2 (TM6SF2-E167K) have been strongly associated with NAFLD. However, these variants cause a fatty liver without systemic metabolic complications, and TM6SF2-E167K has even been shown to protect from myocardial infarction. New treatment possibilities for cardiovascular diseases have risen from studies of loss-of-function (LOF) variants of ANGPTL3. Subjects lacking ANGPTL3 have increased activity of lipoprotein lipase (LPL), low plasma levels of VLDL, LDL and HDL as well as increased insulin sensitivity.
In this thesis study we aimed to elucidate the function of PNPLA3 and TM6SF2 in lipid metabolism of human hepatocytes, and to clarify the mechanism underlying the association between the variants of these genes and increased hepatic lipid accumulation. We also investigated the function of ANGPTL3 in human hepatocytes and characterized the plasma lipoprotein lipidomes of subjects homozygous for ANGPTL3 LOF variants. In these studies, we utilized different lipidomics approaches as well as complementary methods such as microscopy and transcriptomics.
We found using labelled lipid precursors that overexpression of PNPLA3-I148M in hepatocytes leads to a net accumulation of unlabelled triacylglycerols (TAGs) when compared to PNPLA3 wild type (PNPLA3-WT) overexpressing or control cells, but the level of newly synthesized TAGs did not change. Closer examination of the lipid species profiles and further experiments led us to the conclusion that PNPLA3 is a remodelling protein that transfers fatty acids from TAG to phosphatidylcholine (PC) and that PNPLA3-I148M performs this function less efficiently, which may lead to increased hepatic TAG levels. The noticed lipid accumulation could also be related to a more extensive association of PNPLA3-I148M to lipid droplets compared to PNPLA3-WT, which was also observed in our study.
We mimicked the effect of TM6SF2-E167K by knocking down TM6SF2 in hepatocytes. TM6SF2 depletion increased the level of TAGs and cholesterol esters (CEs) and changed the membrane lipid composition of the cells by reducing the amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and increasing the levels of saturated and monounsaturated fatty acids in the lipids. The size of the lipoprotein-like particles secreted by the TM6SF2 deficient cells was reduced, as was β-oxidation of fatty acids. Both of these observations could explain the increased lipid accumulation caused by TM6SF2 depletion. In addition, TM6SF2 knock-down increased lipid turnover and the amount of late endosomes/lysosomes in the cells.
Depletion of ANGPTL3 in hepatocytes lead to PUFA enrichment in major membrane phospholipids and CEs, and the production of PUFA-derived lipid mediators was also increased. In addition, the total level of CEs as well as their synthesis was reduced in ANGPTL3 depleted cells. An examination of the lipidome of lipoproteins derived from ANGPTL3 deficient or control subjects revealed that, in addition to reducing the total levels of all lipid classes, ANGPTL3 deficiency modifies the species composition of the core and surface lipids of lipoproteins, which likely reflects the increased activity of LPL.
These findings increase the knowledge on how genetic NAFDL caused by PNPLA3-I148M or TM6SF2-E167K variant develops and how ANGPTL3 depletion affects the liver and the secreted lipoproteins. This information provides tools for creating future prevention and treatment strategies for cardiometabolic diseases.Kardiometabolisiksi luonnehditut aineenvaihduntahäiriöt, kuten metabolinen oireyhtymä ja alkoholista riippumaton rasvamaksa, lisäävät riskiä sairastua sydän- ja verisuonitauteihin ja tyypin 2 diabetekseen. Alkoholista riippumatonta rasvamaksaa voidaan pitää metabolisen oireyhtymän ilmentymänä maksassa, ja lihavuus on sen suurin yksittäinen riskitekijä, mutta myös geneettiset seikat vaikuttavat maksan rasvoittumiseen. PNPLA3-geenin I148M-variantti (PNPLA3-I148M) sekä TM6SF2-geenin E167K-variantti (TM6SF2-E167K) lisäävät rasvamaksaan sairastumisen riskiä, mutta niiden aiheuttamiin aineenvaihduntahäiriöihin ei liity insuliiniresistenssiä, ja TM6SF2-E167K jopa suojaa sydäninfarktilta. Myös henkilöillä, joilta puuttuu toiminnallinen ANGPTL3-geeni, on vähäisempi riski sairastua sydän- ja verisuonitauteihin, ja siksi ANGPTL3-proteiinin toiminnan estäminen verenkierrossa tai sen tuotannon estäminen maksassa ovat jo edenneet kliinisiin kokeisiin uusina sydän- ja verisuonitautien hoitomuotoina.
Tässä väitöskirjatyössä selvitettiin PNPLA3- ja TM6SF2-proteiinien toimintaa maksasolujen rasva-aineenvaihdunnassa (lipidimetaboliassa) sekä mekanismeja, joilla PNPLA3-I148M ja TM6SF2-E167K aiheuttavat maksan rasvoittumista. Lisäksi tutkittiin ANGPTL3:n puutteen vaikutusta maksasolujen lipidimetaboliaan ja maksasta eritettyjen lipoproteiinien lipidikoostumukseen. Työssä hyödynnettiin etenkin erilaisia lipidomiikan menetelmiä.
Havaitsimme, että PNPLA3 osallistuu glyserolipidien glyserolirunkoon kiinnittyneiden rasvahappojen vaihdantaan. PNPLA3-I148M sai tämän lipidien välisen rasvahappojen siirron häiriintymään, ja lisäksi PNPLA3-I148M hakeutui suuremmissa määrin maksasolujen varastorasvapisaroiden yhteyteen kuin normaali PNPLA3. Nämä tekijät voivat vaikuttaa maksasolujen rasvoittumiseen. Myös TM6SF2:n määrän vähentäminen maksasoluissa, mikä vastaa TM6SF2-E167K:n vaikutusta, muutti solujen lipidimetaboliaa ja johti solujen rasvoittumiseen. Havaituista muutoksista etenkin eritettyjen lipoproteiinin kaltaisten partikkelien koon pieneneminen sekä rasvahappojen β-oksidaation väheneminen selittäisivät maksasolujen rasvoittumista. ANGPLT3:n puute kasvatti maksasolujen monityydyttymättömien rasvahappojen suhteellista osuutta solun kalvolipideissä sekä rasvapisaroiden kolesteroliestereissä, ja lisäksi näistä rasvahapoista valmistettujen lipidimediaattorien tuotanto tehostui. ANGPTL3:n puutos vähensi maksasta eritettyjen lipoproteiinien lipidimääriä sekä vaikutti myös lipoproteiinien pintakalvon ja ytimen lipidien koostumukseen, mikä todennäköisimmin johtui lipoproteiinilipaasin aktiivisuuden suurenemisesta. Tämän väitöskirjatyön tulokset tarjoavat mekanistista perustietoa erityyppisten kardiometabolisten sairauksien ennaltaehkäisyn ja hoidon kehittämiseen
