BURITI, F. C. A.

OLIVEIRA, I. C.

SANTOS, K. M. O. dos

SILVA, L. F. da

Portuguese

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Lactobacillus rhamnosus EM BEBIDA LÁCTEA CAPRINA COMSUCO DE UVA: SOBREVIVÊNCIA A CONDIÇÕESGASTRINTESTINAIS SIMULADAS IN VITRO K. M. O dos Santos1, I.C. Oliveira2, L.F. da Silva3, F.C.A. Buriti4 1  Embrapa Agroindústria de Alimentos, Avenida das Américas,  29501, CEP: 23020-470 – Rio de Janeiro RJ –Brasil, Telefone: (21) 3622-9600 – Fax: (21) 3622-9713, e-mail: karina.dos-santos@embrapa.br2  Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Ceará - Campus Sobral, CEP: 62042-030 – Sobral CE –Brasil, Telefone: (88) 3112-7400 – Fax: (88) 3112-7455, e-mail: oliveira_isabelcristina@yahoo.com.br3 Embrapa Caprinos e Ovinos, Estrada Sobral-Groaíras km 4, CEP: 62010-970 – Sobral CE – Brasil, Telefone: (88)3622-9600 – Fax: (21) 3622-9713, liana.ferreira@embrapa.br4  Universidade Estadual da Paraíba,  Departamento de Farmácia,  Rua Juvêncio Arruda s/n – CEP: 58429-500 –Campina Grande PB – Brasil, Telefone: (83) 3315-3360 – Fax: (83) 3315-3352, flaviaca0123@gmail.comRESUMO – A resistência a condições do trato gastrintestinal (TGI) simuladas  in vitro da cepa nativaLactobacillus rhamnosus  EM1127 (Lr-EM1127),  potencialmente  probiótica,  em bebida láctea caprinafermentada com suco de uva, foi investigada em comparação com cultura probiótica comercial da mesmaespécie  (Lr-32).  A  acidez  titulável  e  o  pH  das  bebidas  foram  monitorados  durante  28  dias  dearmazenamento refrigerado a 6 ± 2 °C, registrando-se gradual aumento da acidez e redução do pH noperíodo. Nos ensaios de digestão in vitro das bebidas observou-se queda de 3,80 e 3,27 log UFC/mL napopulação  de  Lr-EM1127,  respectivamente,  no  primeiro  e  aos  28  dias.  Queda  mais  acentuada  foiregistrada  para  Lr-32,  de  5,03  e  5,42  log  UFC/mL,  respectivamente,  nos  mesmos  períodos.  Asobrevivência de Lr-EM1127 na bebida láctea caprina às condições do TGI in vitro foi superior à da cepacomercial.  O  produto  mostrou  ser  um veículo  adequado  para  a  cepa  potencialmente  probiótica  Lr-EM1127.ABSTRACT – The resistance to the in vitro simulated gastrointestinal (GIT) conditions of an indigenouspotentially probiotic strain of  Lactobacillus rhamnosus (Lr-EM1107) incorporated to a  fermented goatdairy beverage with grape juice was investigated in comparison with a commercial probiotic culture (Lr-32). Titratable acidity and pH of the beverages were measured during 28 days of cold storage (6  ± 2 °C),being registered a gradual increase and decline, respectively, for both beverages. A decrease of 3.80 and3.27  log  cfu/mL  in  Lr-EM1127  population  was  observed during  the  in  vitro digestion  assay of  thebeverage at first  and 28 days,  respectively.  A higher decline was registered for  Lr-32, 5.03 and 5.42cfu/mL, respectively,  in the same periods. The indigenous strain  Lr-EM1127 incorporated to the goatdairy beverage with grape juice survived better to GIT conditions in vitro, compared with the commercialstrain. The product showed to be a suitable vehicle for Lr-EM1127.PALAVRAS-CHAVE: alimentos  probióticos;  leite  de  cabra;  bactérias  láticas  nativas;  resistênciagastrintestinal in vitro. KEYWORDS: probiotic foods; goat milk; wild lactic acid bacteria; in vitro gastrointestinal resistance.1. INTRODUÇÃOA produção de leite de cabra e produtos lácteos caprinos está em expansão no Brasil. O valornutricional, o baixo potencial alergênico e a elevada digestibilidade do leite de cabra (Haenlein, 2004) otornam um alimento promissor para a elaboração de produtos lácteos funcionais. O desenvolvimento dealimentos  probióticos constitui  alternativa relevante para agregação de novas funcionalidades ao leitecaprino e ampliação de seu mercado. Uma alta concentração de células viáveis no alimento, superior a 106 UFC / mL, é consideradanecessária para obtenção dos efeitos benéficos dos probióticos. No entanto, a viabilidade elevada nãogarante  a  sobrevivência  do microrganismo  durante  a  passagem pelo trato gastrintestinal  (TGI)  até  achegada ao intestino, local de sua atuação. A matriz alimentícia na qual o probiótico foi incorporado podeexercer papel relevante em sua proteção durante a passagem pelo TGI. Em função disso, a viabilidade doprobiótico  na  matriz  do  produto  também deve  ser  investigada  após  exposição  a  condições  do  TGI,complementando a avaliação do potencial probiótico do produto  (Buriti et al., 2010).  A avaliação datolerância ao TGI também pode contribuir para a seleção das cepas mais adequadas para incorporação aum determinado produto alimentício, visando favorecer a ação do probiótico ao nível intestinal Lactobacillus rhamnosus,  espécie do grupo  Lactobacillus casei,  apresenta diversas cepas compropriedades  associadas  à  benefícios  à  saúde  e  empregadas  como  probióticos  em  alimentosindustrializados.  A espécie  manifesta  comportamento  associativo com  Streptococcus thermophilus nafermentação  do  leite,  contribuindo  para  a  geração  do  aroma  característico  de  lácteos  fermentados(Oliveira  et  al.,  2012).  Pesquisas  da  Embrapa  com  bactérias  láticas  isoladas  de  queijos  artesanaisresultaram na seleção de cepas de Lb. rhamnosus potencialmente probióticas e com aptidão tecnológicapara uso em produtos lácteos (dos Santos et al., 2014).O desenvolvimento de bebida láctea probiótica a partir de leite e soro lácteo caprinos e suco deuva tem o potencial de congregar diversos benefícios à saúde do consumidor. O soro lácteo oriundo daprodução de queijos contém proteínas de alto valor biológico, bem como outros nutrientes que o tornamum coproduto de interesse para uso na alimentação humana. O suco de uva, além de contribuir para osabor do produto,  contêm teor relevante de polifenóis associados a numerosos efeitos promotores desaúde. O presente  estudo teve como objetivo avaliar  a sobrevivência  da cepa nativa potencialmenteprobiótica Lb. rhamnosus EM1127 em bebida láctea à base de leite e soro lácteo caprino e suco integralde uva a condições do trato gastrintestinal simuladas  in vitro, em comparação com a cultura probióticacomercial Lb. rhamnosus Lr-32. 2. MATERIAL E MÉTODOS2.1 Processamento das bebidas lácteas fermentadas As bebidas lácteas foram produzidas a partir da fermentação de uma base láctea preparada comleite e soro de queijo caprino, produzidos na Embrapa Caprinos e Ovinos, adicionada de suco de uvaintegral. A mistura de leite (40 g / 100 g) e soro lácteo (33 g / 100 g), adicionada de açúcar (7 g / 100 g),foi  submetida  a  tratamento  térmico  a  85  °C/15 min,  seguido de resfriamento  até  37  ±  2  °C.  Nessatemperatura as culturas de  Streptococcus thermophilus (como  starter) e  Lb. rhamnosus (comercial ounativa) foram adicionadas à base láctea, em seguida incubada a 37 °C até atingir pH próximo de 5,0,seguida de resfriamento até 6 ± 2 °C. Após 24 h de estabilização, suco integral de uva foi adicionado àbase láctea na proporção de 20 g / 100 g do produto final. As bebidas foram embaladas em garrafas depolietileno de alta densidade com capacidade de 200 ml e armazenadas a 6 ± 2 °C por um período de 28dias. Três lotes de cada bebida láctea foi produzido, designadas: BL-32 (com a cultura comercial  Lb.rhamnosus Lr-32) e BL-EM1127 (com cepa a nativa Lb. rhamnosus Lr-EM1127). 2.2 Análises fisico-químicas Amostras  das  bebidas  lácteas  BL-32  e  BL-EM1127  foram  coletadas  no  primeiro  dia  apósprocessamento e aos 14 e 28 dias de armazenamento para a determinação da acidez titulável  (Brasil,2006), expressa em ácido lático, e do valor de pH, medido em potenciômetro. 2.3 Viabilidade de Lb. rhamnosus e S. thermophilus nas bebidas A viabilidade de Lb. rhamnosus e S. thermophilus  nas bebidas foi determinada no primeiro diaapós  processamento  e  aos  28  dias  de  armazenamento.  Diluições  decimais  das  amostras,  coletadasassepticamente, foram preparadas em água peptonada. Para a enumeração de Lb. rhamnosus,  1 mL dasdiluições  apropriadas  foi  semeado em profundidade em ágar  MRS acidificado a  pH 5,4,  seguida deincubação  em anaerobiose  a  37  °C  por  48  h.  A  enumeração  de  S.  thermophilus  foi  realizada  porsemeadura em profundidade em ágar M17 adicionado de solução de lactose a 10%, seguida de incubaçãoa 45 °C por 48 h.2.4 Sobrevivência de Lb. rhamnosus a condições do TGI simuladas in vitroAmostras das bebidas foram coletadas no primeiro e aos 28 dias de estocagem refrigerada paraavaliação da sobrevivência das cepas de  Lb. rhamnosus a condições gástricas e entéricas simuladas  invitro, segundo metodologia descrita por Buriti et al. (2010). Diluição decimal das amostras foi preparadacom solução salina e, para a simulação da fase gástrica, o pH foi reduzido a 2,5 com solução de HCl 1 Me  foram  adicionadas  soluções  de  pepsina  e  lipase  até  atingir  concentração  de  3,0  g/l  e  0,9  g/l,respectivamente. Os frascos foram incubados a 37 °C por 2 h sob agitação (150 rpm). Subsequentemente,as condições entéricas foram simuladas em duas fases. Na primeira, o pH foi elevado a 5,0 com soluçãoalcalina  estéril  e  foram adicionadas  bile  bovina  e  pancreatina  até  a  concentração  de  10  g/l  e  1  g/l,respectivamente. Após duas horas de incubação, o pH foi ajustado a 7,0 e as concentrações de bile epancreatina foram ajustadas, respectivamente, a 10 g/l  e 1 g/l na simulação da segunda fase entérica,seguida de duas horas adicionais de incubação. Os valores de pH foram monitorados em cada etapa deavaliação de resistência às condições gastrintestinais.Amostras foram coletadas no início (T0) do ensaio, após a fase gástrica (T1) e ao final do ensaio,após as  fases  entéricas  (T2)  para  a  enumeração de  Lb.  rhamnosus. Diluições  decimais  em série  dasamostras foram preparadas em água peptonada, sendo 1 mL de cada diluição semeado em profundidadeem ágar MRS acidificado a pH 5,4, seguida de incubação em anaerobiose a 37 oC por 48 h.A  taxa  de  sobrevivência  (TS%)  foi  calculada  segundo  Wang  et  al.  (2009)  com  base  naspopulações  iniciais  e  finais,  para  estimar  a  resistência  relativa  das  cepas  de  Lb.  rhamnosus após  oprocessamento da bebida (dia 1) e ao final do período de armazenamento estudado (28 dias). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃOOs valores de pH e acidez titulável das bebidas lácteas BL-32 e BL-EM1127 estão apresentadosna Tabela 1. Foi registrada redução gradual nos valores de pH de ambas as bebidas durante os 28 dias dearmazenamento refrigerado e, paralelamente, observou-se um aumento gradual da acidez titulável nesseperíodo. As populações de Lb. rhamnosus nas bebidas BL-32 e BL-EM1127 mantiveram-se acima de 7,6log UFC/mL durante os 28 dias de armazenamento e as de S. thermophilus permaneceram próximas de9,0 log UFC/mL no mesmo período.Tabela 1. Acidez titulável e pH das bebidas lácteas BL-32 (com a cepa Lr-32) e BL-EM1127 (com a cepaLr -EM1127) durante armazenamento a  6 ± 2 °C.Tratamento Tempo (dias) Acidez titulável (g/100g) pHBL-32 1 0,62 ± 0,00 3,75 ± 0,01 14 0,68 ± 0,01 3,70 ± 0,0128 0,73 ± 0,01 3,62 ± 0,01BL-EM11271 0,66 ± 0,01 3,65 ± 0,0314 0,70 ± 0,03 3,59 ± 0,0128 0,84 ± 0,01 3,50 ± 0,02A Tabela 2 apresenta os resultados dos ensaios de sobrevivência às condições do TGI simuladasin vitro. No primeiro dia após o processamento (dia 1), as populações de Lb. rhamnosus  nas bebidaslácteas BL-32 e BL-EM1127 estavam próximas de 8 log UFC/mL  ao início dos ensaios (T0). Após asimulação da fase gástrica do processo digestivo (T1), a população de Lr-1127 foi reduzida em 3,46 logUFC/mL,  em média,  enquanto uma queda de 5,18 log UFC/mL foi  registrada para  a cepa  Lr-32.  Amesma tendência de queda foi observada aos 28 dias das bebidas, sendo, no entanto, menor no caso daLr-EM1127. Durante a fase entérica do ensaio de sobrevivência, a população de Lr-1127 na bebida recémprocessada (dia 1) apresentou uma ligeira queda (0,25 log UFC/mL), mantendo-se praticamente estávelnessa fase para a bebida aos 28 dias.  Inversamente, observou-se uma pequena recuperação da populaçãode Lr-32 após a exposição da bebida recém processada ao fluido entérico e uma queda menor no caso dabebida aos 28 dias de armazenamento. Considerando o ensaio de digestão in vitro como um todo, a queda na população de Lr-1127 namatriz da bebida láctea caprina com suco de uva foi de 3,80 e 3,27 log UFC/mL, respectivamente, noprimeiro dia e aos 28 dias de armazenamento, resultando em uma taxa de sobrevivência (TS) superior a50% e próxima de 60% ao final do período estudado. Uma queda mais acentuada foi registrada para acultura  Lr-32, de 5,03 e 5,42 log UFC/mL, respectivamente, nos dois períodos de armazenamento dabebida, refletindo em uma menor taxa de sobrevivência. Tabela 2. Sobrevivência de Lb. rhamnosus às condições do TGI simuladas in vitro na matriz das bebidaslácteas caprinas BL-32 (com a cepa Lr-32) e BL-EM1127 (com a cepa Lr -EM1127) após 1 e 28 dias dearmazenamento a  6± 2 °C.TratamentoTempo dearmazenamento(dias)Lb. rhamnosus (log UFC/g)Tempo inicial(T0)Fase gástrica(T1)Fase entérica(T2)Taxa desobrevivência (%)BL-32 1 7,63 ± 0,09 2,45 ± 0,13 2,60 ± 0,32 34,128 7,98 ± 0,14 2,78 ± 0,26 2,57 ± 0,05 32,1 BL-EM11271 7,96 ± 0,03 4,50 ± 0,22 4,16 ± 0,32 52,228 8,16 ± 0,14 4,97 ± 0,25 4,89 ± 0,07 59,9Em conjunto, os resultados dos ensaios de digestão  in vitro  evidenciaram o efeito relevante dafase gástrica na sobrevivência das culturas de Lb. rhamnosus incorporadas à matriz da bebida láctea comsuco de uva, em especial da cultura probiótica de Lb. rhamnosus comercialmente disponível. A secreçãogástrica,  contendo HCl  e pepsina,  representa um dos principais mecanismos de defesa do organismohumano contra a ingestão de microrganismos. Poucas bactérias láticas conseguem resistir  à  passagemgástrica  (Cotter  & Hill,  2003)  e a  resistência  a  essa  etapa do processo digestivo é  uma propriedaderelevante  para  bactérias  probióticas.  Nesta  etapa,  a  cepa  nativa  Lr-EM1127  destacou-se  pela  maiortolerância ao baixo pH e demais componentes do fluido gástrico. Em contrapartida, ambas as  cepas deLb.  rhamnosus  mostraram-se  resistentes à  etapa  entérica  do  ensaio,  apresentando menor  redução nonúmero de células viáveis em comparação à fase gástrica após a exposição ao fluido entérico simulado,contendo sais biliares, lipases e outras enzimas em concentrações similares à do TGI humano. Embora opH mais elevado prevalente no intestino delgado seja mais favorável à sobrevivência, a bile é um agentede  estresse  para  bactérias,  podendo exercer  efeito  deletério  sobre  os  fosfolipídios  e  proteínas  damembrana  celular,  especialmente  de  Gram-positivas.  Uma  boa  tolerância  à  bile  é  importante  parabactérias  probióticas,  que  devem  permanecer  viáveis  no  intestino,  principal  locus das  atividadespromotoras de saúde dos probióticos, tem sido utilizada como critério para a seleção de cepas candidatasa probióticos.  É uma característica que dependente da linhagem, não sendo possível generalizar para onível de espécie (Begley et al., 2005).Adicionalmente,  os  resultados  sugerem  que  a cepa Lr-EM1127  adaptou-se  ao  ambienteproporcionado pela matriz da bebida ao longo do armazenamento pois foi verificado um aumento dasobrevivência da cepa à fase gástrica e ao ensaio como um todo na bebida aos 28 dias, em comparaçãocom o primeiro dia após processamento. Resultados semelhantes foram obtidos por Buriti et al. (2010) aoinvestigar a sobrevivência de Lb. acidophilus em mousse de goiaba, evidenciando um aumento na taxa desobrevivência após estocagem sob congelamento. Os autores consideraram que a exposição prévia doprobiótico  a  fatores  de  estresse,  como  baixa  temperatura  e  pH,  resulta  em aumento  da  resistênciasubsequente a um ambiente desfavorável como as condições gastrintestinais.4. CONCLUSÕESA bebida láctea fermentada caprina com suco de uva mostrou ser um veículo adequado para acepa  potencialmente  probiótica  Lb.  rhamnosus  EM  1127.  A  cepa  nativa  manteve-se  viável  noproduto durante o período de armazenamento estudado e apresentou, nessa matriz, boa resistência àscondições do TGI simuladas  in vitro  em comparação com uma cultura probiótica comercial da mesmaespécie. AGRADECIMENTOSOs autores agradecem à Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária pelo auxílio financeiro e àempresa DuPont™ Danisco® pelo fornecimento de parte dos materiais utilizados neste trabalho.uPontDaniscREFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASBegley, M., Hill, C., & Gahan, C. G. M. (2006). Bile salt hydrolase activity in probiotics.  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Lactobacillus rhamnosus em bebida láctea caprina com suco de uva: sobrevivência a condições gastrintestinais simuladas in vitro.

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