Gene therapy provides a promising option for treatment of various diseases, but the fact remains that the large number of gene delivery systems has met with little therapeutic success. Viral gene delivery has a high degree of specificity and efficacy, but it does not provide sufficient safety for clinical applications. Therefore, the search for an efficient alternative, a synthetic gene delivery vector, has been active.
Typically, non-viral delivery vectors are based on the use of cationic polymers which bind and compact DNA via electrostatic interactions into nanoparticles (polyplexes). The ability of a cationic polymer to bind and condense DNA is important for effective delivery because good packing not only protects DNA against degradation in the extracellular space, but also allows effective release of DNA inside cells. While cationic polymers are relatively nontoxic and safe, they lack significant efficacy. This major drawback of non-viral vectors is largely due to a poor understanding of the mechanism underlying the complexation and gene delivery process. Furthermore, the lack of reliable methods to study the binding between DNA and cationic polymers has hindered development in synthetic gene delivery systems.
The aim of this study was to investigate the mechanisms of DNA complex formation and gene transfer mediated by cationic polymers with different structures (poly-L-lysine, PLL; polyethylenimines, PEIs; poly-β-amino esters, PBAEs) and transfection efficiencies.
This thesis combines time-resolved fluorescence spectroscopy with cell transfection studies in order to elucidate how polymer structure can affect DNA binding and influence gene delivery outcomes. This method allows the quantitative determination of polymer–DNA interaction and binding. We showed that the mechanism of PEI–DNA and PLL–DNA complex formation was positively cooperative with a saturation limit near 100% at a polymer/DNA molar (N/P) ratio of 2, whereas most of PBAE–DNA complexes expressed negative cooperativity and reached a saturation level close to 80%. The polymer topology, the type of amines (primary, secondary and tertiary) and their density, and the environmental pH had a clear effect on the binding constants and the degree of cooperativity. The possible correlation between fluorescence parameters and transfection efficiency was investigated with a series of PBAEs. Their transfection efficiency showed an increasing trend in association with the relative efficiency of PBAE–DNA nanoparticle formation.
The role of free polymer in polyplex formation and gene delivery was examined with PEI as a model vector. For PEI polyplexes, the formation of the polyplex core was completed at N/P 2 and the excess of polymer formed a protective shell around the core. Unlike PLL, PEI molecules were able to undergo an exchange between the core and shell of the polyplexes. Such differences in structural dynamics of these polyplexes may partly provide an explanation for the differences seen in their DNA release and transfection efficacy at the cellular level. The excess of PEI in the shell had no effect on the physical state of polyplexes, suggesting that the polyplex core retains its original structure during shell formation. However, the excess of PEI was a crucial factor in successful transfection. The role of free PEI in the gene transfection process was examined in cell cultures with modified cell-surface glycosaminoglycans content. This study showed that free PEI is essential for minimizing the undesirable binding of polyplexes to cell-surface glycosaminoglycans, which may otherwise pose a barrier in non-viral gene delivery. Lastly, we focused on the role of PEI structure in PEI–liposome–DNA delivery systems (lipopolyplexes). We found that the enhancement of lipopolyplex-mediated delivery by different types of PEI species is common and associated with PEI size rather than structure.
In conclusion, the present study demonstrated that the fluorescence spectroscopy approach for the analysis of gene delivery systems can provide valuable quantitative information about the binding behaviour of various cationic polymers to DNA. The improved understanding of mechanisms behind formation of these complexes can contribute to the design of polymeric delivery vectors with improved properties. Furthermore, this study sheds light on the mechanisms by which free polymer enhances gene transfer. It explains why high N/P ratios are needed for effective transfection and how the interactions between free polymer and cell-surface GAGs lead to alterations in gene transfer by the polyplexes.Geeniterapia on lupaava vaihtoehto useiden sairauksien hoitoon. Tähän mennessä kehitetyt geenien siirtotekniikat eivät ole kuitenkaan vastanneet niille asetettuja odotuksia. Virusvektorien avulla tehty geeninsiirto on spesifistä ja tehokasta, mutta se ei ole tarpeeksi turvallista kliinisiin sovelluksiin. Siksi tehokkaita synteettisiä eli muuhun kuin viruksiin perustuvia vektoreita etsitään jatkuvasti.
Synteettiset vektorit ovat yleensä kationisia polymeerejä, jotka sitovat ja pakkaavat DNA:ta sähköstaattisilla vuorovaikutuksilla nanopartikkeleiksi (polyplekseiksi). Hyvä vektori suojaa DNA:ta hajoamiselta solun ulkopuolella, mutta päästää DNA:n vapaaksi solun sisällä. Kationisilla polymeereillä ei ole samanlaisia turvallisuus ongelmia kuin virusvektoreilla, mutta tähän mennessä tutkitut polypleksit eivät ole virusvektoreihin verrattuna kovin tehokkaita. Jotta voitaisiin kehittää tehokkaampia DNA-polypleksejä, niiden muodostumisen ja geenien siirron mekanismit tulisi ymmärtää paremmin.
Tämän työn tarkoituksena oli tutkia miten kationisen polymeerin kemiallinen rakenne vaikuttaa polypleksien muodostumiseen ja geeninsiirron tehokkuuteen. Polymeereinä käytettiin poly-L-lysiiniä (PLL), polyetyleeni-imiinejä (PEI) ja poly-β-aminoestereitä (PBAE). Aikaerotteisilla fluoresenssimittauksilla saatiin kvantitatiivista tietoa polymeerin ja DNA:n välisistä vuorovaikutuksista. PEI–DNA- ja PLL–DNA-polypleksien muodostumisen havaittiin olevan positiivisesti kooperatiivista ja niiden sitoutumisisotermit saturoituivat noin 100%:iin N/P-suhteen ollessa noin kaksi. Sen sijaan PBAE–DNA-kompleksien muodostuminen oli negatiivisesti kooperatiivista ja niiden sitoutumisisotermit saturoituivat noin 80% kohdalle. Polymeerien topologia, amiiniryhmien tiheys ja tyyppi (primaarinen, senkundaarinen ja tertiaarinen) sekä ympäristön pH vaikuttivat sekä sitoutumisvakioon että kooperatiivisyyteen. PBAE-polymeereillä havaittiin transfektiotehokkuuden korreloivan PBAE–DNA-nanopartikkelien muodostumisen suhteellisen tehokkuuden kanssa.
Polymeerin määrän vaikutusta polypleksien muodostumiseen ja geenisiirtoon tutkittiin PEI:n ja PLL:n avulla. Näillä polymeereillä polypleksin ydin on valmis, eli muodostunut nanopartikkeli on sähköisesti neutraali, kun N/P-suhde on noin kaksi. Suuremmilla N/P-suhteilla ytimen muodostumisesta ylijäävä polymeeri muodostaa suojaavan kuoren polypleksin ytimen ympärille. PEI-polyplekseissä molekyylit pääsivät vaihtumaan ytimen ja kuoren välillä, mutta PLL-polyplekseille vaihtoa ei tapahdu. Tällaiset erot polypleksien rakenteellisessa dynamiikassa voivat osaltaan selittää solutasolla havaittuja eroja näiden vektoreiden transfektiotehdokkuudessa. Kuoren polymeeri ei vaikuta polypleksin fysikaaliseen tilaan, joten polypleksin ydin säilyttää alkuperäisen rakenteensa kuoren muodostuessa sen ympärille. Kuoren polymeerillä on kuitenkin tärkeä rooli transfektion onnistumisessa. Tämän ns. vapaan polymeerin roolia geenin siirrossa tutkittiin PEI:n avulla käyttämällä solulinjaa, jonka pinnan glykosanimoglykaanimäärää oli muunneltu. Saatujen tulosten perusteella vapaa PEI estää polypleksien haitallista sitoutumista glykosanimoglykaaneihin. Tämä havainto selittää osaltaan miksi tehokas geeninsiirto vaatii korkeita N/P-suhteita.
Lopuksi tutkittiin PEI:n kemiallisen rakenteen vaikutusta lipopolyplekseissä eli PEI-liposomi-DNA-polyplekseissä. PEI:n havaittiin edistävän lipopolypleksi-välitteistä geeninsiirtoa ja PEI:n koolla havaittiin olevan suurempi merkitys kuin sen kemiallisella rakenteella.
Yhteenvetona voidaan todeta tämän tutkimuksen osoittavan, että fluoresenssispektroskopian avulla voidaan saada arvokasta kvantitatiivista tietoa kationisten polymeerien ja DNA:n välisestä sitoutumisesta. Lisäksi tämän tutkimuksen aikana saatiin lisätietoa mekanismeista, joiden avulla vapaa polymeeri edistää geeninsiirtoprosessia. Saatuja tuloksia voidaan hyödyntää parempien geeninsiirtovektoreiden kehittämisessä
