ALVES, M. de C.

CARNEIRO, A. A.

LACERDA, F.

VALADARES, W.

VASCONCELOS, M. J. V. de

Portuguese

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REGENERAÇÃO IN VITRO DE CULTIVARES DE Sorghum bicolor VIA EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA  Wanessa Valadares (1,3); Fabiane Lacerda (1,3); Maria José Vilaça de Vasconcelos (2); Meire de Cássia Alves (2); Andréa Almeida Carneiro (2) (1) Graduanda em Agronomia / Universidade Federal de São João Del Rey (2) Embrapa Milho e sorgo (3) Colaboração semelhante no desenvolvimento do projeto    Introdução  Sorgo é o quinto cereal mais cultivado do mundo (SATO et al., 2004). A produtividade do sorgo no Brasil é variável, em média 2.500 kg/ha. Programas de melhoramento têm trabalhado intensamente para aumentar a produtividade de diferentes linhagens. Alternativamente, a tecnologia do DNA recombinante e a geração de plantas transgênicas também têm sido utilizadas na melhoria genética do sorgo. Entretanto, o sorgo é extremamente recalcitrante quando cultivado in vitro (KISHORE et al., 2006) e o sucesso da aplicação das modernas técnicas de transformação genética de plantas requer a utilização de genótipos com alta capacidade de regeneração (OLDACH et al., 2001; KISHORE et al., 2006). Os protocolos de transformação genética de planta são desenvolvidos para genótipos adaptados à propagação in vitro, tanto por organogênese quanto por embriogênese. Para a obtenção de um protocolo eficiente de transformação genética de sorgo é necessário que a sua regeneração em cultura de tecidos seja otimizada.  Culturas de calos embriogênicos são classificadas em Tipos I e/ou II e são normalmente formadas quando o material vegetal é cultivado em meios suplementados com auxinas, tais como 2,4-D (PETRILLO et al., 2008). Os calos do Tipo I são estruturas compactas, amarelas ou brancas e, normalmente, capazes de regenerar planta. Os calos do Tipo II são macios, friáveis e altamente embriogênicos (ARMSTRONG; GREEN, 1985). Embora ambos os calos sejam capazes de regenerar plantas, as culturas formadoras de calos do Tipo II crescem mais rapidamente, podem ser mantidas por um longo período de tempo e formam um grande número de embriões somáticos (VASIL, 1987). Estas características favorecem a seleção e regeneração de plantas transgênicas (QUE et al., 2014). A formação de calos embriogênicos do Tipo II é observada em um número limitado de genótipos de sorgo (ELKONIN et al., 1995; KAEPPLER;  PEDERSON, 1997). Desse modo, existe a necessidade de identificação de linhagens elite com alta capacidade regenerativa em cultura de tecidos e o desenvolvimento de protocolos de regeneração. Portanto, esta pesquisa teve como objetivo a identificação de genótipos de sorgo capazes de regenerar eficientemente pelo processo de embriogênese somática, visando posteriormente sua utilização na geração de plantas transgênicas. Foram avaliados 3 genótipos de sorgo quanto a sua capacidade de formar calos embriogênicos do Tipo II em presença de 2,4-D.   Materiais e Métodos  Material Vegetal: Três linhagens de sorgo do banco germoplasma da Embrapa Milho e Sorgo BRS 508, BRS 509, BRS 511 foram testadas quanto a sua eficiência de formação de calos embriogênicos e regeneração em cultura de tecidos. Neste estudo foram utilizadas inflorescências jovens com 3,0 a 5,0 cm de comprimento. Sementes de estas cultivares foram plantadas em canteiros na Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas-MG e aproximadamente 120 dias após o plantio as inflorescências foram coletadas. Esterilização do material vegetal: Aproximadamente 15 cm de colmos contendo as inflorescências imaturas foram coletados e desinfestadas em etanol 70% e água estéril. Em seguida, em câmara de fluxo laminar as folhas foram retiradas com o auxílio de um bisturi, deixando-se somente a panícula. As panículas foram cortadas em fragmentos de aproximadamente 5 mm.  Meio de cultivo: Os meios de cultivo utilizados para a regeneração in vitro de sorgo nas várias etapas do processo foram aqueles desenvolvidos por Brandão et al. (2005) e estão descritos na Tabela 1. A solução contendo sais, sacarose e 2,4-D foi autoclavada e os demais constituintes esterilizados por filtração adicionados à solução já autoclavada. Indução de calos embriogênicos: Fragmentos das panículas foram transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura CIMRS (Meio de indução de calos) selados com filme PVC e cultivados em câmara de crescimento, no escuro, a 26-28 °C por 30 dias, com um subcultivo após 15 dias. Regeneração e germinação: Oito gramas de calos embriogênicos foram transferidos para 3 placas contendo meio de maturação RM por 2-3 semanas, no escuro a 26-28 °C. Os calos maduros foram transferidos para novas placas contendo meio de germinação (meio H). Para germinação as placas foram incubadas em ambiente iluminado a 26-28 °C e um fotoperíodo de 16/8 h (luz/escuro). Aclimatização: Plantas com aproximadamente 5 cm e duas a três folhas foram transferidas para vasos contendo solo, vermiculita e areia na proporção de 1:1:1. O número de plantas regeneradas a partir de 8 g de calos embriogênicos foi registrado para cada cultivares estudados. Na primeira semana em casa de vegetação as plântulas permaneceram protegidas sob uma cobertura plástica transparente para aclimatização.  Tabela 1. Composição dos Meios de Cultura usados para a Regeneração de Sorgo Sacarino  Constituinte Meio CIMRS Meio RM Meio H Sais MS Sais 4,3 g 4,3 g 4,3 g Regulador de Crescimento  2-4 D  1 mg/L 2,5 mL 0 0 ANA 1mg/L 0 200 µL 0 Vitaminas Myo-Inositol 100 mg 100 mg 0 Prolina 0,7 g 0 0 Solução TG 1,0 mL 0 0 Vitaminas MS 0 1,0 mL 1,0 mL Suplementos  L- Asparagina 100 mg 0 0 Cinetina 200 µL 0 0 MES 0,5 g 0 0 PVPP 10 g 0 0 Sacarose 30 g  60 g  30 g  Tioxin 2,0 mL 0 0 Phytagel  3,0 g 4,0 g 3,0 g  Resultados e discussão:  A composição do meio de cultura é um fator importante na morfogênese in vitro (ELKONIN; PAKHOMOVA, 2000; SATO et al., 2004). A regeneração de vários genótipos de sorgo, por meio de embriogênese somática indireta, tem sido descrita a partir de diferentes meios de cultura. Alguns estudos têm comparado o efeito dos sais basais, MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) e N6 (CHU et al., 1975), na indução de calos embriogênicos em diferentes cultivares de sorgo e têm constatado forte influência do genótipo na produção de calos e habilidade de regeneração in vitro (LUSARDI; LUPOTTO, 1990; ELKONIN et al., 1995; KAEPPLER; PEDERSEN, 1996; SATO et al., 2004). Esses trabalhos observaram que, em alguns genótipos, a formação de calos embriogênicos de boa qualidade e regeneráveis ocorre em meio com N6 sais, e outras em meio com MS sais. A principal diferença entre estas formulações de sais é que os sais MS contêm uma concentração total mais alta de nitrogênio inorgânico, mas uma mais baixa relação de nitrato de amônio do que N6 sais (ARMSTRONG et al., 1991; ELKONIN; PAKHOMOVA, 2000). Neste projeto foi testado o meio MS suplementado com 2,4-D para a indução de calos embriogênicos a partir de inflorescência imatura com 3 a 5 cm de comprimento. De acordo com Cai e Butler (1990), inflorescências de sorgo entre 2 e 5 mm de comprimento são ótimas para a formação de calos e a regeneração de plantas in vitro. Segundo Gupta et al. (2006), a utilização de inflorescências imaturas de sorgo pode superar a limitação genotípica de maneira mais prática do que a utilização de embriões imaturos. Nossos resultados revelaram que em meio CIMRS suplementado com 2,4-D e antioxidantes (ácido ascórbico e PVPP), todas as linhagens foram capazes de formar calos embriogênicos com eficiência variável (Tabela 2). A linhagem BRS509 foi a que produziu o maior número de calos embriogênicos e um menor escurecimento do meio de cultivo. O escurecimento observado é em razão provavelmente do acúmulo de compostos fenólicos no meio de cultivo (OBERTHUR et al., 1983) (Figura 1). Tabela 2. Número de calos desenvolvidos a partir de  fragmento de inflorescências   Cultivar BRS 508 BRS 509 BRS 511  N° Total de Explantes  72 calos 60 calos 123 calos N° de Calos Desenvolvidos ¹  59 calos 56 calos 86 calos % em cima do n° total de calos  81,9% 93,3% 69,9%         ¹ contagem realizada antes dos calos serem transferidos para o meio de cultura RM (maturação)  Os compostos fenólicos são derivados do metabolismo secundário, os quais exercem importante papel no metabolismo de muitas espécies de plantas, bem como na defesa contra predadores e microrganismos. No entanto, no cultivo in vitro de sorgo, a produção de compostos fenólicos pode prejudicar a formação de calos e o desenvolvimento da planta (KRESOVICH et al., 1987; GEORGE, 1996; ZHU et al., 1998). O dano causado nas células, durante a excisão dos explantes, leva à liberação dos compostos fenólicos, precursores da síntese de lignina, pelo tecido injuriado (GEORGE; SHERRINGTON, 1984). Esses compostos fenólicos são oxidados pelas enzimas polifenases, produzindo substâncias tóxicas, inibindo o crescimento dos explantes, além de escurecer o meio de cultura, ocasionando, não raramente, até a morte deles (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).      Figura 1. Calos embriogênicos de sorgo. (A) BRS 508; (B) BRS509; (C) BRS511. Os calos embriogênicos desenvolvidos foram transferidos para o meio de Maturação (RM) contendo ANA e sem 2,4-D, neste meio não houve adição de PVPP.  Calos embriogênicos que tinham um fenótipo transparente e aquoso tornaram-se brancos opacos entre 3 e 4 semanas de incubação (Figura 2).       Figura 2. Calos embriogênicos de sorgo maduros. Observe as estruturas esbranquiçadas e o início de desenvolvimento de raízes.   Calos maduros foram transferidos para o meio de germinação e plântulas germinadas foram observadas a partir da segunda semana.  Plantas foram obtidas a partir de todas as linhagens, sendo que a linhagem BRS509 foi a mais eficiente (Tabela 3 e Figura 3).  A B C Tabela 3. Número de plântulas que regeneraram a par tir de 8 gramas de calos maturados  Cultivar BRS 508 BRS 509 BRS 511  Quantidade em gramas de Calos Maturados  8,0 g 8,0 g 8,0 g Nível de Oxidação  ++ + ++ N° de Plântulas que Regeneraram  28 plântulas 32 plântulas 16 plântulas *  + baixo escurecimento do meio; ++ médio: +++ alto Figura 3. Calos de sorgo germinando. (A) BRS 508; (B) BRS 509; (C) BRS 511. Neste projeto a regeneração in vitro através da embriogênese somática de três linhagens de sorgo BRS508, BRS509 e BRS511 foi avaliada. Todas as linhagens foram capazes de formar calos embriogênicos e produzir plantas. A linhagem BRS509 foi a que mais se destacou podendo ser utilizada futuramente para o desenvolvimento de protocolos para transformação genética utilizando Agrobacterium tumefaciens.  Referências  ARMSTRONG, C. L.; GREEN, C. E. 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Regeneração in vitro de cultivares de Sorghum bicolor via embriogênese somática.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/1060977/1/Regeneracaoinvitro.pdf

Regeneração in vitro de cultivares de Sorghum bicolor via embriogênese somática.

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