Sucrose permeability as a marker of gastric mucosal integrity in the horse : Feasibility, assay development and field validation of a blood test for diagnosis of gastric ulcers in horses

Abstract

Gastric ulcers can develop in foals and horses of all breeds and uses, and the term equine gastric ulcer syndrome (EGUS) has been coined to describe this disease because of its multifactorial and complicated nature. Currently, detection of EGUS by gastroscopy is the only reliable ante mortem method for definitive diagnosis in horses, and is considered the gold standard against which all other diagnostic tests are compared. Disadvantages of gastroscopy are that it requires the horse to be sedated, it is not readily available to most veterinarians, it is an inefficient expenditure of time, and requires a minimum level of expertise to perform and interpret. A urine sucrose test has been reported to be a reliable method of detecting gastric ulcers in horses; however, technical difficulties associated with urine collection have limited the practical value of the test. It was hypothesized that blood sucrose concentration following nasogastric administration of sucrose can be used as a simple, economical alternative to reliably and practically detect gastric ulcers in horses; and a series of studies were subsequently conducted to develop and validate the test, including determination of the feasibility of the method; sucrose assay development and standardization; and field validation through determination of the performance characteristics of the test in selected populations of horses. The feasibility of the method was determined in 12 adult horses with naturally occurring gastric ulceration. Horses with moderate to severe gastric ulceration demonstrated a significant increase in serum sucrose concentrations at 30, 45, 60 and 90 minutes following nasogastric administration of sucrose. Peak sucrose concentrations occurred at 45 minutes and were correlated with ulcer severity. It was concluded that the determination of sucrose concentration in blood is a feasible alternative to urine when performing sucrose permeability testing in the horse, and may represent a useful screening test for identifying horses with endoscopically visible gastric ulceration. An accurate, yet practical and cost-effective method for quantifying sucrose in equine serum that can be applied to sucrose permeability testing in the horse was subsequently developed and validated using gas chromatography with flame ionization detection (GC-FID). The assay provided an acceptable degree of linearity, accuracy and precision at concentrations of sucrose as low as 2.34 µmol/L and as high as 20.45 µmol/L. Percentage recovery of sucrose from serum ranged from 89 – 102%; and repeatability and intermediate precision (RSD %) ranged from 3.6 to 6.7 % and 4.1 to 9.3 % respectively. The limit of detection was 0.73 µmol/L. It was concluded that the method is valid; and can be applied to the assessment of gastric permeability in the horse. The performance characteristics of the test were subsequently assessed in a large group of adult horses and foals with naturally occurring gastric ulceration by comparing it to gastroscopy as the gold standard. The diagnostic accuracy of blood sucrose for diagnosis of gastric lesions (GL); glandular lesions (GDL); squamous lesions (SQL); and clinically significant lesions (CSL) at 45 and 90 minutes after administration of 1 g/kg of sucrose via nasogastric intubation was assessed using receiver operator characteristics (ROC) curves and calculating the area under the curve (AUC). For each lesion type, sucrose concentration in blood was compared to gastroscopy as the gold standard; and sensitivities (Se) and specificities (Sp) were calculated across a range of sucrose concentrations. Ulcer grading was performed blindly by one observer; and the results were validated by comparing them with that of two other observers, and calculating the level of agreement. Cut-off values were selected manually to optimize Se. Because of concerns over the validity of the gold standard, additional Se, Sp, and lesion prevalence data were estimated and compared using Bayesian latent class analysis. Using the traditional gold standard approach, the prevalence of GL; GDL; SQL and CSL for adult horses was 83%; 70%; 53% and 58% respectively. For foals, the prevalence of GL; GDL; SQL and CSL before weaning was 21%; 9%; 7% and 8% respectively; and increased to 98%; 59%; 97% and 82% respectively after weaning. At the selected cut-offs, Se ranged from 51% to 79% for adult horses; and 84% to 95% for foals, depending upon the lesion type and time of sampling. Sp was poor, ranging from 43% to 72%; and 47% to 71% in adult horses and foals respectively. Estimates of Se and Sp were consistently higher in foals when using a Bayesian approach, however there was little difference between the methods when compared in adult horses. It was concluded that blood sucrose is neither a sensitive or specific test for detecting EGUS in adult horses and is therefore unsuitable as a screening test this study population. In contrast, blood sucrose appears to be a sensitive test for detecting EGUS in foals. Due to its poor specificity, it is not expected that the sucrose blood test will replace gastroscopy, however it may represent a clinically useful screening test to identify foals that may benefit from gastroscopy. Bayesian latent class analysis may represent an alternative method to evaluate the diagnostic accuracy of gastric permeability tests in an attempt to avoid bias associated with the assumption that gastroscopy is a perfect test.Mahahaavoja esiintyy sekä varsoilla että aikuisilla hevosilla rotuun tai käyttöön katsomatta. Useiden taustatekijöiden ja monimuotoisen taudinkuvan vuoksi sairaudesta käytetään termiä EGUS eli Equine Gastric Ulcer Syndrome. Mahalaukun tähystys eli gastroskopia on diagnostiikan ideaalisin eli gold standard -menetelmä ja ainoa luotettava kliininen diagnosointitapa. Tähystys vaatii hevosen rauhoittamisen, eikä kaikilla eläinlääkäreillä ole toimenpiteeseen vaadittavaa välineistöä eikä tulkintaan vaadittavaa kokemusta. Virtsan sokerin (sakkaroosin eli sukroosin) analyysin on raportoitu olevan luotettava menetelmä hevosen mahahaavan diagnostiikassa, mutta virtsan kerääminen on teknisesti hankalaa eikä testi näin ollen ole käytännöllinen. Tutkimushypoteesina oli että sokerin nenänieluletkulla tapahtuvan annostelun jälkeen veren sokerikonsentraation analysointi olisi yksinkertainen, käytännöllinen ja taloudellinen vaihtoehto todentaa hevosen mahahaavat luotettavasti. Testin kehittämiseksi ja validoimiseksi tehtiin sarja tutkimuksia: sokerin mittaustestin kehittäminen ja standardisointi, testaustekniikan käytännöllisyys, sekä testin validointi valikoidussa hevospopulaatiossa. Metodin soveltuvuus määritettiin 12 aikuisella hevosella, joilla oli todettu mahahaava. Hevosilla, joilla oli kohtalainen tai vakava mahahaava, sokerin konsentraatio nousi merkittävästi 30, 45, 60 and 90 minuuttia sokerin nenänieluletkutuksen jälkeen. Sokerin huippupitoisuus oli 45 minuutin kohdalla, ja korreloi haavauman vakavuuden kanssa. Johtopäätöksenä todettiin, että veren sokerin läpäisevyystesti verrattuna virtsan sokerin konsentraation mittaamiseen on käyttökelpoinen vaihtoehto seulontatestinä jolla löydetään mahahaavahevoset. Sokerin mittaamiseen hevosen seerumista kehitettiin ja validoitiin tarkka, käytännöllinen ja taloudellinen menetelmä käyttäen kaasukromatografiaa ja liekki-ionisaatio detektoria (GC-FID). Analyysi oli riittävän tarkka ja lineaarinen sekä matalilla (2.34 µmol/L) että korkeilla (20.45 µmol/L) sokerikonsentraatioilla. Seerumiin sokeripitoisuuden määrä vaihteli välillä 89 - 102%; toistettavuus välillä 3.6 - 6.7%, sekä tarkkuus (intermediate precision; RSD %) välillä 4.1 - 9.3%. Menelmän mittausraja oli 0.73 µmol/L. Menetelmän todettiin olevan pätevä ja sitä pystyttiin käyttämään hevosen mahalaukun läpäisevyyden tutkimisessa. Testin toimivuutta mahalaukun tähystykseen verrattuna arvioitiin laajan aineiston avulla. Ryhmissä oli sekä aikuisia hevosia että varsoja. Veren sakkaroosipitoisuus arvioitiin 45 ja 90 minuuttia 1 g/kg sokeriannoksen nenänieluletkuksen jälkeen. Pitoisuuden diagnostinen tarkkuus mahalaukun (GL), ja sen eri osien (rauhasalue (GDL), keratinisoitunut alue (SQL)) vaurioiden, sekä kliinisesti merkittävien vaurioiden (CSL) arvioitiin käyttäen ROC- käyrää ja laskemalla alle jäävä ala (AUC). Sokerin pitoisuutta veressä eri vauriotyypeissä verrattiin gastroskopialöydöksiin (gold standard), herkkyys ja tarkkuus. Mahahaavojen luokittelun suoritti sokkoutettu tutkija, tulokset validoitiin kahden muun arvioinnilla ja näistä laskettiin yksimielisyyden taso (the level of agreement). Herkkyyden parantamiseksi raja-arvot valittiin manuaalisesti. Gastroskopia gold standard -testinä ei ole tarkka, joten herkkyys, tarkkuus ja vaurioiden esiintyvyys arvioitiin ja vertailtiin Bayesian latentilla luokka-analyysilla. Perinteisellä gold standard -menetelmällä vaurioiden esiintyvyydet aikuisella hevosella olivat GL 83%, GDL70%, SQL 53% ja CSL 58%. Varsoilla vaurioiden esiintyvyydet olivat GL 21%, GDL 9%, SQL 7% ja CSL 8% ennen vieroitusta, sen jälkeen ne nousivat 98%, 59%; 97% and 82%. Valituilla raja-arvoilla aikuisten hevosten testin herkkyys oli 51 - 79% ja varsojen 84-95% riippuen vaurion tyypistä ja näytteenottoajasta. Tarkkuus oli heikko vaihdellen 43-72% aikuisilla ja 47–71% varsoilla. Herkkyys ja tarkkuusarviot olivat kauttaaltaan korkeampia varsoilla, jos käytettiin Bayesian mallia, aikuisilla metodeilla ei ollut juuri eroa. Loppupäätelmänä todettiin että veren sakkaroosipitoisuuden testi ei ole herkkä tai tarkka testi hevosen mahahaavalle aikuisella hevosella, eikä sovellu seulontatestiksi. Sen sijaan varsoilla veren sokeripitoisuus näyttäisi olevan herkkä testi mahahaavan (EGUS) toteamiseen. Todennäköisesti testi ei korvaa tähystystä huonon spesifisyytensä takia, mutta se voisi toimia käytännöllisenä testinä arvioitaessa varsojen tarvetta tähystykseen. Bayesian latentti luokka- analyysi voi olla toimiva testivaihtoehto mahan läpäisevyyden arvioimiseen,,koska gold standard –testissä on puutteita