BARON, L. F.

BEDENDO, G. C.

FONSECA, F. M. da

KRABBE, E. L.

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 107  VALIDAÇÃO DE MÉTODO CROMATOGRÁFICO (CLAE-UV) PARA QUANTIFICAÇÃO DE AMINAS BIOGÊNICAS  Lana Flávia Baron1, Francisco Noé da Fonseca2, Gizelle Cristina Bedendo2 e  Everton Luís Krabbe3 1Graduanda em Farmácia pela Universidade do Contestado, Campus Concórdia, Estagiária da Embrapa Suínos e Aves, Bolsista CNPq/PIBIC, lanaflaviabaron@hotmail.com. 2Analistas da Embrapa Suínos e Aves. 3Pesquisador da Embrapa Suínos e Aves.  Palavras-chave: aminas biogênicas, cromatografia, derivatização.  INTRODUÇÃO As aminas biogênicas são substâncias de baixo peso molecular que possuem importância biológica em animais, vegetais e células microbianas com funções fisiológicas variadas. São geradas a partir da descarboxilação enzimática ou microbiana de aminoácidos e da transaminação de aldeídos e cetonas (1, 2). A avaliação desses compostos é de extrema importância, pois em concentrações elevadas nos alimentos possuem efeitos tóxicos. Segundo a forma de ação, as aminas são divididas em psicoativas (histamina, putrescina, cadaverina) que tem ação nos neurotransmissores, e quando ocorre intoxicação, causam vômito, diarreia, hipotensão e cefaleia. Outra divisão, são as aminas vasoativas (tiramina, triptamina, feniletilamina) que atuam no sistema vascular, causando crises hipertensivas, enxaquecas, dificuldade de respirar e palpitações (2). Em animais, dietas com altas concentrações de aminas acarretam queda no desempenho (3). Diversas metodologias estão descritas na literatura para a determinação de aminas biogênicas em produtos alimentícios, tais como embutidos, laticínios, peixes, etc, (2,4); dentre elas, merece destaque a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção no ultravioleta (CLAE-UV). Neste contexto, o presente trabalho objetivou validar um método por CLAE-UV para quantificação de aminas biogênicas em alimentos.  MATERIAL E MÉTODOS O método de quantificação das aminas biogênicas foi validado em termos de seletividade, linearidade e precisão. Foram utilizadas como marcadores as seguintes aminas biogênicas: histamina, tiramina, 2-feniletilamina, triptamina, putrescina, cadaverina, espermina e espermidina. Foram preparadas estoque individuais com concentração de 1 mg/mL em HCl 0,1M em balão volumétrico, as quais foram diluídas em mesmo balão (mix de padrões) na faixa de concentração de 0,2, 0,5, 1, 5, 10, 20, 25 µg/mL. Estas soluções foram derivatizadas utilizando cloreto de dansila como agente derivatizante e 1,7-diaminoheptano como padrão interno conforme descrito previamente por Smela et al. (4) com modificações. Em um tubo, foram adicionados 1 mL do mix, 0,5 mL de tampão NaOH:NaHCO3 (2:3, pH 14) e 2 mL de cloreto de dansila na concentração de 5 mg/mL solubilizado em acetonitrila. O sistema foi agitado em vórtex por 1 min e deixado em repouso protegido da claridade por 1 h. Após este período, foram adicionados 0,1 mL de NH4OH e o sistema foi agitado (vórtex, 30 s) e deixado em repouso (30 min) para finalizar a reação. Aos tubos, foi adicionado 1 mL de NaCl saturado e em seguida foi realizado a extração das aminas biogênicas derivatizadas com éter etílico (3x0,5 mL). As fases orgânicas foram unidas em um tubo e o solvente foi evaporado com aquecimento (50 °C) e N2. O resíduo, por fim, foi ressuspendido em 1 mL de acetonitrila, seguido de filtração (0,22 µm) e análise cromatográfica. Para tal, foi utilizado um cromatógrafo líquido (Dionex Ultimate 3000, Thermo Fischer) composto por detector de arranjo de diodos (UV-Vis), bomba multicanal e injetor automático. A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna de fase reversa C18 (150 x 4,6 mm, 5µm) acoplada a pré-coluna C18 (10 x 4,6 mm, 5µm), gradiente eluição utilizando água e acetonitrila e ʎ= 254 nm. A partir dos resultados das áreas, foi calculado o fator de relação (FR) das aminas biogênicas em relação ao padrão interno e os dados foram plotados em software adequado (Excel 2007, Microsoft) para obtenção das curvas de calibração (n=5). A precisão foi determinada a partir do coeficiente de variação das injeções (em triplicata) na concentração mais baixa, média e mais alta da curva. A seletividade foi obtida com a análise do perfil cromatográfico de eluição da mistura de padrões.  RESULTADOS E DISCUSSÃO O método cromatográfico para quantificação de aminas biogênicas mostrou-se seletivo para os compostos de interesse (Figura 1), sendo possível a identificação de todos os compostos. A concentração de 0,2 não gerou sinal satisfatório para a maioria das aminas, o que dificultava a integração dos picos, sendo, então, excluída da análise da linearidade. Após a regressão linear dos FR (razão entre área do pico do padrão e do padrão interno) dos diferentes padrões, foram obtidos coeficientes de correlação (r) de 0,998 para a espermidina e espermina e 0,999 para as demais aminas biogênicas (Tabela 1), indicando que a resposta dos analitos variou linearmente na faixa estudada (0,5 – 25 µg/mL). Por fim, determinou-se o coeficiente de variação (CV) (tabela 2) da concentração baixa, média e alta da curva de calibração e os valores foram abaixo de 5%, com exceção da tiramina no menor nível (6%), porém considerando que o método envolve diferentes etapas de reação seguida de extração orgânica, os valores de CV obtidos podem ser considerados satisfatórios.    108  CONCLUSÕES O método proposto mostrou-se seletivo, linear e preciso nas faixas de concentração de 0,5 – 25 µg/mL. Ainda, estudos adicionais são necessários para verificar a adequabilidade do método estabelecido na análise das aminas biogênicas em produtos alimentícios.  REFERÊNCIAS 1. CARDOZO, M. et al. Biogenic Amines: A Public Health Problem. Revista Virtual de Química, [s.l.], v. 5, n. 2, p.149-168, mar. 2013. Sociedade Brasileira de Química (SBQ). 2. CUNHA, F. L. et al. Determinação de aminas biogênicas em diferentes tipos de queijos por cromatografia líquida de alta eficiência. Instituto Adolf Lutz, São Paulo, v. 71, n. 1, p.69-75, 2012. 3. REGINA, R. et al. Nutrição animal, principais ingredientes e manejo de aves e suínos. São Paulo: Fundação Cargill, 2010. 4. SMELA, D. et al. Liquid Chromatographic Determination of Biogenic Amines in a Meat Product during Fermentation and Long-term Storage. Czech J. Food Sci., Brno, República Tcheca, v. 21, n. 5, p.167-175, 2003.   Figura 1. Perfil cromatográfico das aminas biogênicas derivatizadas com cloreto de dansila. Padrão interno: 1,7-diaminoheptano.  Tabela 1. Coeficiente de correlação das curvas de calibração das aminas biogênicas. Amina Biogênica Coeficiente de correlação (r) Triptamina 0,999 2-feniletilamina 0,999 Putrescina 0,999 Cadaverina 0,999 Histamina 0,999 Tiramina 0,999 Espermidina 0,998 Espermina 0,998   Tabela 2. Coeficiente de variação do baixo, médio e alto nível da curva calibração das aminas biogênicas. Amina Biogênica Coeficiente de Variação (%) 0,5 µg/mL 10 µg/mL 25 µg/mL Triptamina 2,19 2,55 1,38 2-feniletilamina 3,29 1,87 1,34 Putrescina 2,80 2,66 1,54 Cadaverina 3,29 2,45 0,87 Histamina 5,16 2,51 0,88 Tiramina 6,09 2,57 0,78 Espermidina 2,37 4,04 3,20 Espermina 1,66 4,87 5,30  

Validação de método cromatográfico (CLAE-UV) para quantificação de aminas biogênicas.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/1059180/1/final8411.pdf

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