GOMES, E. A.

LANA, U. G. de P.

OLIVEIRA-PAIVA, C. A.

PORTUGAL, A. F.

TAVARES, A. N. G.

VALICENTE, F. H.

Portuguese

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

  Avaliação do Impacto de Eventos Comerciais de Milho Bt sobre a Microbiota do Solo Ubiraci Gomes de Paula Lana(1,2); Amanda Nayê Guimarães Tavares(3); Eliane Aparecida Gomes(4); Christiane Abreu de Oliveira (4); Arley Figueiredo Portugal(1); Fernando Hercos Valicente(4).   (1) Analista de Pesquisa; Embrapa Milho e Sorgo; Sete Lagoas, MG; ubiraci.lana@embrapa.br; (2) Professor; Centro Universitário de Sete Lagoas - UNIFEMM; (3) Estudante, Bolsista FAPEMIG, Faculdade Ciências da Vida; (3) Pesquisador, Embrapa Milho e Sorgo.  RESUMO: Eventos de milho geneticamente modificado (GM) expressando proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis (Bt) têm sido cultivados comercialmente no Brasil desde a safra 2008/2009. O objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto de sete eventos comerciais de milho Bt sobre a comunidade microbiana do solo. A qualidade biológica do solo foi avaliada utilizando-se as técnicas de Biolog (diversidade metabólica) e T-RFLP (diversidade genética) em amostras de solo não rizosférico e rizosférico dos eventos de milho DKB 390 YG, FORMULA TL, MORGAN 20A78HX, DKB 390 PRO X, 2B587 POWER CORE, DKB 390 PRO 2 e IMPACTO VIPTERA e seus respectivos isogênicos tratados e não tratados com inseticida químico. As amostras foram coletadas aos 30 e 60 dias após a germinação em Janaúba - MG, safra 2015/2016. Após 72 h de incubação das placas de Biolog, foram observados valores elevados da atividade e da diversidade metabólica (Índice de Shannon) no solo rizosférico em comparação com solo não rizosférico. Entretanto não foram detectadas diferenças significativas entre os eventos transgênicos e os tratamentos convencionais. Além disso, também não foi observada diferença significativa na diversidade genética, avaliada por T-RFLP, das comunidades de bactérias e fungos micorrízicos arbusculares (FMA) entre genótipos convencionais e eventos GM. Foi verificada uma tendência de agrupamento baseada no período da coleta, mostrando a importância do estágio de desenvolvimento da planta na modulação da comunidade de FMA. Os eventos de milho Bt comercializados no Brasil avaliados neste trabalho não apresentam impacto significativo sobre a estrutura das comunidades bacterianas e de FMA do solo, com base nos parâmetros estudados.   Termos de indexação: Monitoramento, Milho Transgênico Bt, Microrganismos do Solo. INTRODUÇÃO Atualmente, cerca de 18 milhões de agricultores em todo mundo já adotam o cultivo de plantas geneticamente modificadas (GM). O Brasil é o segundo maior produtor mundial, ocupando uma área de 44,2 milhões de hectares em 2015 (JAMES, 2016). Vários eventos comerciais de milho GM expressando proteínas de Bacillus thuringiensis (Bt) estão sendo cultivados no Brasil.   Diversos trabalhos têm sido realizados com o objetivo de avaliar o impacto de eventos de milho GM para resistência a insetos sobre a microbiota do solo (CASTALDINI et al., 2005; ZENG et al., 2014). Porém, os resultados obtidos por esses trabalhos são controversos e escassos em condições tropicais. A influência das proteínas Bt sobre a composição da microbiota ainda é pouco compreendida. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto de sete eventos comerciais de milho Bt sobre a comunidade microbiana do solo.  MATERIAL E MÉTODOS Coleta e preparo do solo rizosférico Os genótipos comerciais de milho DKB 390 YG, FORMULA TL, MORGAN 20A78HX, DKB 390 PRO X, 2B587 POWER CORE, DKB 390 PRO 2, IMPACTO VIPTERA e seus respectivos genótipos isogênicos tratados e não tratados com o inseticida químico Lannate® BR foram cultivados em triplicatas em Janaúba - MG safra 2015/2016. Aos 30 dias (fase vegetativa) e 60 dias (florescimento) após o plantio, foram coletadas raízes de cinco plantas de cada genótipo. Cinco gramas das raízes finas com o solo fortemente aderido (rizosférico) foram colocadas em tubos cônicos e o volume foi completado para 50 mL com solução de pirofosfato de sódio 0,15% (m/v). Após agitação a 130 rpm por 30 min, as raízes foram removidas e 5 mL do sobrenadante foram transferidos para outro tubo para análise de diversidade metabólica. O restante da amostra foi centrifugado por 30 min a 10.000 rpm, o sobrenadante descartado e o pellet, solo rizosférico, foi armazenado a -80 °C.   Biolog Para a determinação da atividade (AWCD) e diversidade metabólica por meio do índice de diversidade de Shannon (H) foram utilizadas placas Ecoplates com diferentes fontes de carbono (Biolog, Inc., Hayward, CA, EUA). Um volume de 5 mL da solução de pirofosfato de sódio 0,1% (m/v) contendo solo da etapa anterior foi centrifugado por 15 minutos a 4.000 rpm e o sobrenadante foi diluído 50X. Cada poço da placa de Biolog foi inoculado com 120 μL da solução e as placas foram incubadas a 28 °C. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro (Labstems, MultSkan, MS, EUA) com comprimento de onda de 590 nm, nos intervalos de 24, 48, 72, 96 e 120 h de incubação. A leitura de 72 h (tempo médio) foi utilizada para estimar os valores de AWCD e H (ZAK et al., 1994), que foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey a 5% de probabilidade utilizando o programa SISVAR (FERREIRA, 2011).   T-RFLP O DNA genômico do solo rizosférico foi extraído utilizando o kit Power Soil DNA Isolation (MoBIO La., Inc., EUA). Para análise de bactérias, fragmentos do gene 16S rRNA foram amplificados utilizando os primers 8F marcado na posição 5’ (6-FAM) e 1492R (LAMONTAGNE et al., 2002). Para a amplificação do gene 23S rRNA de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) foi utilizado nested-PCR a partir de reação com primers LR1 e FLR2 (TROUVELOT et al., 1999). Para a 2ª reação de PCR foram utilizados 2,5 μL do produto da 1ª reação e os primers FLR3 (6-FAM) e FLR4 (NED) (GOLLOTTE et al., 2004). Os fragmentos amplificados das regiões 16S e 23S rDNA foram digeridos com as enzimas restrição AluI e TaqI, respectivamente. Os fragmentos de DNA foram detectados no equipamento Genetic Analyzer 3500XL com GeneMapper 5.0. (Applied Biosystems) e analisados no software T-REX (CULMAN et al., 2009). Os dados foram ordenados por escalonamento multidimensional não-métrico (NMDS) a partir de uma matriz de similaridade de Jaccard utilizando o programa Past versão 3.04 (HAMMER et al., 2001).   RESULTADOS E DISCUSSÃO Atividade e diversidade metabólica  As comunidades bacterianas apresentaram diferenças na utilização das fontes de carbono em função das fases de desenvolvimento da cultura (coleta) e do material genético (genótipo). As diferenças foram significativas para atividade metabólica (AWCD) e para o índice de Shannon (H). Valores elevados de AWCD (2,2 - 2,6) e H (3,3 - 3,4) foram observados no solo rizosférico em comparação com solo não rizosférico (AWCD = 0,1; H = 2,2 - 2,6). Aos 30 e 60 dias do desenvolvimento da cultura, as comunidades microbianas dos eventos Bt e isogênicos tratados ou não com inseticida químico não apresentaram diferenças significativas na atividade e diversidade metabólica, diferindo apenas em relação ao solo não rizosférico (Tabela 1). No entanto, os métodos dependentes do cultivo in vitro de microrganismos, como o Biolog, apresentam limitações, uma vez que algumas bactérias não podem ser cultivadas, incorrendo em uma seletividade para determinados grupos de bactérias (ZAK et al., 1994). Portanto, para complementar as análises, a diversidade genética foi avaliada por T-RFLP, uma técnica que independe do cultivo dos microrganismos.  Diversidade genética Para avaliarmos a influência dos diferentes eventos transgênicos sob a diversidade genética dos microrganismos presentes na rizosfera foi utilizada a técnica de T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism). Nesse estudo, as amostras de solo rizosférico distanciaram-se das amostras de solo não rizosférico na projeção bidimensional das comunidades bacterianas (Figura 1), indicando diferenças nítidas na estruturação das comunidades microbianas, que podem ser influenciadas por diversos fatores, como o tipo de solo e exsudação de compostos pela raiz, que podem influenciar no crescimento dos microrganismos da rizosfera (YANG; CROWLEY, 2000). Entretanto, os pontos de ordenação não mostraram uma tendência no agrupamento entre as comunidades bacterianas dos genótipos. Foi verificada uma tendência de agrupamento de FMA baseada no período da coleta (Figura 2), mostrando a importância do estágio de desenvolvimento da planta na modulação da estrutura de FMA. Assim, os pontos de ordenação não mostraram uma tendência no agrupamento entre as comunidades bacterianas e de FMA dos genótipos de milho transgênico e convencional, em consonância com outros estudos (BECKER et al., 2014; ZENG et al., 2014; CHEEKE et al., 2015).   CONCLUSÕES Os eventos de milho Bt comercializados no Brasil avaliados neste trabalho não apresentam impacto significativo sobre a estrutura das comunidades bacterianas e de fungos micorrízicos arbusculares do solo, com base nos parâmetros estudados.   AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Célio Ramos das Neves pelo auxílio na coleta das amostras e à Embrapa e Fapemig pelo apoio financeiro.   REFERÊNCIAS BECKER, R.; BUBNER, B.; REMUS, R.; WIRTH, S.; ULRICH, A. Impact of multi-resistant transgenic Bt maize on straw decomposition and the involved microbial communities. Applied Soil Ecology, Amsterdam, v. 73, p. 9-18, 2014.  CASTALDINI, M.; TURRINI, A.; SBRANA, C.; BENEDETTI, A.; MARCHIONNI, M.; MOCALI, S.; FABIANI, A.; LANDI, S.; SANTOMASSIMO, F.; PIETRANGELI, B.; NUTI, M. P.; MICLAUS, N.; GIOVANNETTI, M. Impact of Bt corn on rhizospheric and soil eubacterial communities and on beneficial mycorrhizal symbiosis in experimental microcosms, Environmental Microbiology, Washington, v. 71, p. 6719-6729, 2005.   CHEEKE, T. E.; SCHUTTE, U. M.; HEMMERICH, C. M.; CRUZAN, M. B.; ROSENSTIEL, T. N.; BEVER, J. D. Spatial soil heterogeneity has a greater effect on symbiotic arbuscular mycorrhizal fungal communities and plant growth than genetic modification with Bacillus thuringiensis toxin genes. Molecular Ecology, Oxford, v.24, p. 2580-2593, 2015.  CULMAN, S. W.; BUKOWSKI, R.; GAUCH, H. G.; CADILLO-QUIROZ, H.; BUCKLEY, D. H. T-REX: Software for the processing and analysis of T-RFLP data. BMC Bioinformatics, v. 10, p. 171-180, 2009.  FERREIRA, D. F. Sisvar: a computer statistical analysis system. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 35, n. 6, p. 1039-1042, nov./dez. 2011.  GOLLOTTE, A.; VAN TUINEN, D.; ATKINSON, D. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi colonising roots of the grass species Agrostis capillaris and Lolium perenne in a field experiment. Mycorrhiza, Berlin, v. 14, p. 111-117, 2004. HAMMER, O.; HARPER, D. A. T.; RIAN, P. D. Past: Palaeonthological statistics software package for education and data analysis: version. 1.37. 2011. Disponível em:<http://palaeo-electronica.org/2001_1/past/issue1_01. htm>. Acesso em: 28 mar. 2016.  JAMES C. Global status of commercialized Biotech/GM crops. Ithaca: ISAAA, 2016.  LAMONTAGNE, M. G.; MICHEL, JR.; HOLDEN, P. A.; REDDY, C. A. Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 49, p. 255-264, 2002.  TROUVELOT, S.; Van TUINEN, D.; HIJRI, M.; GIANINAZZI-PEARSON, V. Visualization of ribosomal DNA loci in spore interphasic nuclei of glomalean fungi by fluorescence in situ hybridization. Mycorrhiza, Amsterdam, v. 8, p. 203-206, 1999.  YANG, C. H.; CROWLEY, D. E. Rhizosphere microbial community structure in relation to root location and plant iron nutritional status. Applied and Environmental Microbiology, New York, v. 66, p. 345-351, 2000.  ZAK, J. C.; WILLING, M. R.; MOOREHEAD, D. L.; WILDMAN, H. G. Functional diversity of microbial communities: a quantitative approach. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 26, p. 1101-1108, 1994.  ZENG, H.; TAN, F.; ZHANG, Y.; FENG, Y.; SHU, Y.; WANG, J. Effects of cultivation and return of Bacillus thuringiensis (Bt) maize or the diversity of the arbuscular mycorrhizal community in soils and roots of subsequently cultivated conventional maize. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 75, p. 254-263, 2014.  Tabela 1. Atividade (AWCD) e diversidade metabólica (Índice de Shannon - H) determinadas por BIOLOG da população bacteriana de amostras de solo não rizosférico (controle) e solo rizosférico de sete genótipos comercias de milho transgênico Bt e respectivos isogênicos, tratados (ISO + I) ou não (ISO) com o inseticida químico Lannate® BR coletadas no Município de Janaúba-MG, safra 2015/2016.     Atividade (AWCD) Diversidade metabólica (H) Genótipo Transgene Bt  Coleta 1 30 dias Coleta 2 60 dias Coleta 1 30 dias Coleta 2 60 dias Solo não rizosférico - 0,110 a* 0,049 a 1,898 a 2,252 a DKB 390 YG Cry1Ab 2,535 b     2,407 b   3,389 b 3,348 b ISO DKB 390 - 2,473 b    2,217 b   3,405 b 3,324 b ISO DKB 390 + I - 2,468 b     2,452 b     3,388 b 3,370 b FÓRMULA TL  Cry1Ab 2,415 b   2,460 b     3,409 b 3,351 b ISO FÓRMULA - 2,638 b 2,489 b   3,406 b 3,372 b ISO FÓRMULA + I - 2,630 b 2,563 b     3,390 b 3,388 b MORGAN 20A78 HX  Cry1F 2,428 b     2,444 b     3,398 b 3,357 b ISO MORGAN   - 2,467 b   2,377 b    3,355 b 3,353 b ISO MORGAN + I  - 2,555 b 2,478 b     3,398 b 3,347 b DKB 390 PRO X  Cry1A.105, Cry2Ab2 2,570 b 2,578 b     3,391 b 3,373 b ISO DKB 390  - 2,473 b     2,217 b     3,405 b 3,324 b ISO DKB 390 + I  - 2,468 b     2,452 b     3,388 b 3,370 b 2B587 POWER CORE  Cry1A.105, Cry2Ab2, Cry1F  2,453 b     2,399 b     3,369 b 3,319 b ISO 2B587   - 2,415 b     2,341 b     3,398 b 3,380 b ISO 2B587 + I   - 2,543 b 2,393 b    3,383 b 3,373 b DKB 390 PRO 2  Cry1A.105, Cry2Ab2 2,532 b 2,345 b     3,412 b 3,345 b ISO DKB 390  - 2,528 b     2,603 b     3,411 b 3,402 b ISO DKB 390 + I  - 2,468 b     2,452 b     3,388 b 3,370 b IMPACTO VIPTERA  Vip3Aa20 2,545 b 2,585 b     3,383 b  3,415 b ISO IMPACTO  - 2,495 b     2,343 b     3,412 b 3,365 b ISO IMPACTO + I   - 2,437 b     2,535 b     3,403 b 3,390 b * Valores seguidos da mesma letra não diferem significativamente a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.     * Valores eguidos da mesma letra entre linhas não diferem significativamente a 5% de probabilidad  p lo teste de Tukey                 Figura 1. Análise de escalonamento multidimensional não métrico (MDS) da diversidade genética, determinada por T-RFLP, de bactérias de amostras de solo não rizosférico (controle) e solo rizosférico de sete genótipos de milho Bt e isogênicos tratados ou não com o inseticida químico Lannate® BR, coletadas aos 30 e 60 dias após plantio em Janaúba-MG, safra 2015/2016. As setas indicam as amostras de solo não rizosférico.                    Figura 2. Análise de escalonamento multidimensional não métrico (MDS) da diversidade genética, determinada por T-RFLP, de fungos micorrízicos arbusculares de amostras de solo não rizosférico (controle) e solo rizosférico de sete genótipos de milho Bt e isogênicos tratados ou não com o inseticida químico Lannate® BR, coletadas aos 30 e 60 dias após plantio em Janaúba-MG, safra 2015/2016. As setas indicam o solo não rizosférico e o círculo em vermelho destaca o agrupamento preferencial das amostras coletadas aos 60 dias após o plantio.  NMDS Eixo 2 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25Coordinate 1-0,20-0,16-0,12-0,08-0,040,000,040,080,120,16Coordinate 2   • Genótipo Bt    • Isogênico    •  Isogênico + Inseticida     • Solo não rizosférico        0,16    0,12    0,08    0,04    0,00   -0,04   -0,    -0,1    -0,16   -0,20  -0,20            -0,15             -0,10            -0,05            0,00           0,05           0,10             0,15            0,20             0,25               NMDS Eixo 1 -0,20 -0,16 -0,12 -0,08 -0,04 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16Coordenada 1 (14,6%)-0,20-0,16-0,12-0,08-0,040,000,040,080,120,16Coordenada 2 (6,5%)     0,1     0,12    0,08    0,04    0,00   -0,04   -0,08   -0,12   -0,16   -0,20    • Genótipo Bt    • Isogênico    •  Isogênico + Inseticida     • Solo não rizosférico NMDS Eixo 2    -0,20           -0,16            -0,12           -0,08            -0,04           0,00             0,04            0,08             0,12            0,16      NMDS Eixo 1 NMDS Eixo 2 NMDS Eixo 2 

Avaliação do impacto de eventos comerciais de milho Bt sobre a microbiota do solo.

https://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/1054132/1/Avaliacaoimpactoeventos.pdf

Avaliação do impacto de eventos comerciais de milho Bt sobre a microbiota do solo.

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