Short-chain triacylglycerols (SC-TAGs) comprise at least one esterified fatty acid with two to six carbon atoms. A high molar proportion of SC-TAGs in bovine milk fat (MF) is a unique feature among edible fats and oils and results in characteristic biological, chemical, physical, and technological properties of MF. Further, high content of SC-TAGs induces specific requirements for TAG analysis. The main objective of the present study was to develop chromatographic (gas chromatography, GC; normal-phase high-performance liquid chromatography, np-HPLC) and mass spectrometric (MS) (electron ionization MS, EI–MS; electrospray ionization MS, ESI–MS/ESI–MS/MS) methods to separate, identify, and quantify regio- and acyl chain isomers of SC-TAG species in model TAG mixtures and in butterfat (BF).
An improved method was developed to fractionate BF TAGs into saturated, monoene, and polyene TAGs on a solid-phase extraction column in silver ion mode prior to GC and GC–EI–MS. This method enabled quantification of otherwise coeluting regio- and acyl chain isomers of SC-TAG species with the same number of acyl carbons but different degree of unsaturation.
The elution order of the acyl chain isomers of isobaric TAG species and the regioisomers of SC-TAGs on a polarizable phenyl(65%)methylsilicone GC-column was empirically established using retention indices calculated for a high number (112) of synthesized TAG species and isomers. Separation power of the column proved to be high enough to resolve the regioisomers of mono-SC-TAGs. Correspondingly, np-HPLC was shown to resolve the regioisomers of mono- and dibutyryl TAGs to the baseline, monocaproyl TAGs close to the baseline, and dicaproyl TAGs partially. Even few regioisomer pairs of long-chain TAGs containing fatty acyl 20:0 were resolved as well. The present study established that in ESI–MS/MS, the cleavage of SC-acyls (4:0, 6:0) from the sn-1(3) positions of mono-SC-TAGs was at least 2.3 times higher than that from the sn-2 position, hence enabling clear-cut differentiation between regioisomers.
Due to intricate TAG composition of BF specific molar correction factors (MCFs) were used in quantification of TAGs by GC, GC–EI–MS, and np-HPLC–ESI–MS. In both MS methods, extensive variation in MCFs was observed due to different molecular size, degree of unsaturation, and regio- and acyl chain isomerism of TAGs, but substantial number (>100) of empirically determined MCFs enabled extrapolation of MCFs for more uncommon TAGs. Both MS methods provided new information that emphasized the need to use specific MCFs for the sn-1(3) and sn-2 TAG isomers.
All quantification methods yielded relatively unsurprising and similar general distribution of TAG classes and selection of the most common TAG species in BF. However, 64 minor TAGs of 336 even-numbered TAG species that were determined by np-HPLC–ESI–MS were confirmed for the first time to exist in BF. A high number of them were SC-TAGs including monoacetyl TAGs, rare sn-2 isomers of mono-SC-TAGs, and di- and tri-SC-TAGs.
The present study suggested that the developed methods were reliable choices to determine both the most common TAGs and more rare TAGs in BF. All methods enabled quantification of the regioisomers of SC-TAGs in BF. The methods can be adapted to detect adulteration of MF, to elucidate biological or technological function of MF, and to develop effective procedures of MF modification. They can be applied to investigation of structured TAGs with short-chain fatty acyls.Lyhytketjuisiin triasyyliglyseroleihin (SC-TAG) on esteröityneenä vähintään yksi lyhytketjuinen rasvahappo, joka sisältää 2–6 hiiliatomia. Maitorasvan (MF) TAG-koostumus eroaa muista yleisistä ravintorasvoista ja -öljyistä siinä, että SC-TAG:ien osuus (mol-%) on MF:ssa poikkeuksellisen suuri, mikä vaikuttaa MF:n biologisiin, kemiallisiin, fysikaalisiin ja teknologisiin ominaisuuksiin ja tekee MF:n TAG:ien analysoinnista haasteellista. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää kromatografisia (kaasukromatografisia, GC; normaalifaasinestekromatografisia, np-HPLC) ja massaspektrometrisiä (MS) (elektroni-ionisaatio-MS, EI–MS; sähkösumutusionisaatio-MS, ESI–MS / ESI–MS/MS) menetelmiä erottamaan, tunnistamaan ja kvantitoimaan voirasvan (BF) SC TAG:ien asyyliketju- ja sn 1(3)/sn 2-paikkaisomeereja.
Tutkimuksessa kehitettiin yksinkertainen hopeaioni-kiinteäfaasiuuttomenetelmä (Ag-SPE), jota käytettiin fraktioimaan BF:n TAG:t tyydyttyneisiin ja kerta- ja monityydyttymättömiin TAG:eihin. Ag-SPE:n käyttö ennen GC- ja GC–EI–MS-analyysejä mahdollisti samanaikaisesti eluoituvien, mutta eri tyydyttyneisyysasteisten SC-TAG:ien asyyliketju- ja sn 1(3)/sn 2-paikkaisomeerien kvantitoinnin GC:sti ja GC–EI–MS:sti.
TAG:ien ja TAG-isomeerien eluointijärjestyksen määrittämiseksi 112 erilaista TAG:a ja TAG-isomeeria syntetisoitiin kemiallisella vaihtoesteröinnillä ja niille määritettiin retentioindeksit (RI) polarisoituvalla fenyyli(65%)metyylisilikoni-GC-kolonnilla. RI-vertailu osoitti, että kolonnin erotuskyky oli riittävä erottamaan kaikkien mono-SC-TAG:ien sn 1(3)/sn 2-paikkaisomeerit toisistaan. Vastaavasti havaittiin, että peräkkäin kytketyt np-HPLC-kolonnit (3 kpl) erottivat täydellisesti kaikkien mono- ja dibutyryyli-TAG:ien ja lähes täydellisesti monokaproyyli-TAG:ien paikkaisomeerit toisistaan sekä dikaproyyli-TAG:ien isomeerit osittain. Yllättäen myös sellaisten pitkäketjuisten-TAG:ien, joihin oli esteröityneenä C20:0-rasvahappo, sn 1(3)/sn 2-paikkaisomeerit erottuivat toisistaan. Tutkimus osoitti lisäksi, että ESI–MS/MS:ssa lyhytketjuiset asyylit (C4:0, C6:0) lohkeavat vähintään 2,3 kertaa helpommin SC-TAG:ien sn-1(3)- asemista kuin sn-2-asemasta, mikä mahdollistaa vastaavien paikkaisomeerien erottamisen tällä menetelmällä.
Kaikissa kvantitointimenetelmissä (GC, GC–EI–MS ja np-HPLC–ESI–MS) käytettiin spesifisiä, molaarisia korjauskertoimia (MCF) TAG:eille. Molemmissa MS-menetelmissä todettiin TAG:ien molekyylikoon, tyydyttyneisyyden ja asyyliketju- ja sn 1(3)/sn 2-paikkaisomerian vaikuttavan MCF:iin, minkä vuoksi oli välttämätöntä käyttää spesifisiä MCF:a myös SC-TAG:ien sn 1(3)/sn 2 paikkaisomeerien kvantitoinnissa. Kokeellisesti määritettyjen MCF:ien verraten suuri lukumäärä (>100) mahdollisti harvinaisempien TAG:ien MCF:ien päättelemisen.
Kaikilla käytetyillä menetelmillä pystyttiin luotettavasti määrittämään TAG-jakautuma ja yleisimmät TAG:t BF:ssa. BF:sta määritettiin np-HPLC–ESI–MS:sti kaikkiaan 336 erilaista parillista TAG:a, joista 64:ä ei ole aiemmin kokeellisesti todettu BF:ssa. Suuri osa uusista TAG:eista oli monoasetyyli-TAG:ja, harvinaisia mono-SC-TAG:ien sn-2-isomeereja ja di/tri-SC-TAG:ja.
Tässä tutkimuksessa käytetyillä menetelmillä pystyttiin kvantitoimaan BF:n SC-TAG:t ja niiden sn 1(3)/sn 2-paikkaisomeerit. Käytetyt menetelmät ovat sovellettavissa MF-väärennysten havaitsemiseen, MF:n biologisten ja teknologisten ominaisuuksien tutkimiseen ja MF:n muokkauksen seurantaan. Ne soveltuvat myös räätälöityjen SC-TAG:ien analysointiin
