双酚A与四溴联苯醚（BDE-47）暴露对紫贻贝组织病理与生殖相关基因表达的研究

Abstract

近年来，海洋污染日益严重，海洋环境中的内分泌干扰物对海洋生物及海洋生态系统的影响，已成为近年来的研究热点。软体动物作为生物界第二庞大的生物类群，在生态系统中扮演着重要的角色，同时也常被用作生态健康评价的指示生物。目前，对于软体动物生殖和内分泌系统的研究甚少，虽然一些研究揭示了脊椎动物的性激素同样存在于软体动物中，但是关于这些性激素的合成通路及参与这些通路的酶类还亟待研究。17&beta;-羟基类固醇脱氢酶是一类多功能的酶，参与了性腺甾醇、脂肪酸、类视黄醇和胆汁酸等物质的代谢。卵黄蛋白原是卵黄蛋白的前体，通常只在性成熟的雌性中表达，但是在外源激素作用下，在雄性及幼体中也可能表达。本研究选取紫贻贝作为研究对象，采用RACE等方法克隆到两种类型17&beta;-羟基类固醇脱氢酶基因的全长序列与卵黄蛋白原的部分序列，并选择了典型的内分泌干扰物BPA和BDE-47作为暴露物，结合实时荧光定量PCR技术与组织病理学等技术，探讨了内分泌干扰物对紫贻贝内分泌系统的影响，从而为表征内分泌干扰效应敏感指标的筛选提供科学依据。本论文获得如下结果： ⑴基因的克隆与序列分析 10型和12型17&beta;-羟基类固醇脱氢酶的基因全长为916 bp和1196 bp，分别编码259和325个氨基酸。两种基因推断的氨基酸序列都含有保守的TGXXXGXG 结构域，催化三联体结构域（丝氨酸 - 酪氨酸 - 赖氨酸），保守的YXXXK活性结构域，其中酪氨酸作为活性催化碱基。克隆获得的卵黄蛋白原片段长为712 bp，位于保守的卵黄蛋白原结构域内。系统进化树分析结果表明，10型和12型17&beta;-HSD所处的位置与其分类学位置相符合，10型17&beta;-HSD与8型17&beta;-HSD进化上关系较近，12型17&beta;-HSD与3型17&beta;-HSD关系较近。 ⑵基因的组织分布特征 组织分布结果显示，两种类型的17&beta;-羟基类固醇脱氢酶均呈多组织分布特征，主要表达于性腺与消化腺组织，而卵黄蛋白原基因则主要表达于雌性贻贝的血细胞、消化腺和性腺，在雄性中几乎不表达。 ⑶典型内分泌干扰物的暴露下基因表达变化 急性暴露实验结果显示，BPA及BDE-47暴露均显著降低了两种类型17&beta;-HSDs基因的表达。在雌雄贻贝中，两种基因的表达量在24 h显著减少（P&lt;0.05），随着暴露时间的延长，在96 h雌性贻贝逐步恢复到对照水平，而雄性贻贝还处于显著抑制的状态。雌雄贻贝卵黄蛋白原基因在BPA及BDE-47暴露下，表达量均出现先上升后下降的趋势，各处理组的基因表达量在48 h均发生显著变化（P&lt;0.05）。亚慢性暴露实验的结果与急性暴露结果类似，受到上述污染物暴露后，17&beta;-羟基类固醇脱氢酶基因的表达量出现下降，而卵黄蛋白原基因表达量出现上升。同时，亚慢性暴露结果表明暴露剂量与检测效应之间存在一定的关系，即高浓度处理组对上述基因的诱导效果比低浓度处理组更显著。 ⑷典型内分泌干扰物的暴露下组织病理分析 组织学分析结果表明，BPA和BDE-47均能对紫贻贝的性腺、鳃和消化腺组织造成损伤，且随着浓度的升高，损伤的程度加大。造成的损伤包括使卵巢滤泡体积变小，数量减少，影响卵母细胞的发育，影响雄性贻贝的精细胞发育；鳃组织的纤毛断裂扭曲，上皮细胞肿胀，鳃叶萎缩变短，鳃丝断裂；消化腺组织的细胞肿胀严重，胞质溶解造成局部坏死，大范围内出现空泡化现象。<br /