Modulación de la vía Glu-NO-GMPc y del aprendizaje por GMPc extracelular en cerebelo. Mecanismos moleculares implicados. Alteraciones en modelos animales de hiperamonemia y encefalopatía hepática

Abstract

En modelos animales de hiperamonemia y encefalopatía hepática (EH) está disminuida la capacidad de aprendizaje de un test de discriminación condicionada en el laberinto en Y. La infusión crónica intracerebral de GMPc mediante bombas osmóticas restaura la capacidad de aprendizaje en el laberinto en Y en ratas con hiperamonemia crónica. El mecanismo por el que el GMPc extracelular modula la capacidad de aprendizaje no se conoce. La vía glutamato (Glu)-óxido nítrico (NO)-GMPc modula el aprendizaje en el laberinto en Y. La función de esta vía está alterada en modelos animales de hiperamonemia y EH, conduciendo a una disminución de la capacidad de aprendizaje en el laberinto en Y. Puesto que la adición de GMPc restaura la capacidad de aprendizaje de esta tarea, es posible que el GMPc añadido restaure la función de la vía Glu-NO-GMPc en cerebelo y de esta forma restaure la capacidad de aprendizaje. El objetivo general fue estudiar si el GMPc extracelular modula la función de la vía glutamato-óxido nítrico (NO)-GMPc en cerebelo in vivo, analizándolo por microdiálisis. También se utilizaron cortes de cerebelo ex vivo de ratas control y con hiperamonemia crónica para analizar en detalle los mecanismos de modulación de la vía por el GMPc extracelular. Los resultados obtenidos muestran que el tratamiento crónico intracerebral con GMPc extracelular restaura la actividad motora en ratas hiperamonémicas y esto podría ser consecuencia de la disminución de la neuroinflamación. Restaura la coordinación motora porque normaliza los niveles de GABA extracelular en cerebelo. Recupera (i) la memoria de referencia y el índice de aprendizaje pero no la memoria de trabajo en el laberinto radial y (ii) la capacidad de aprendizaje espacial en el test del laberinto acuático de Morris. A esta recuperación podrían contribuir la normalización de los niveles de GMPc y la reducción de la neuroinflamación en hipocampo por el GMPc extracelular. Existe un rango de concentración de GMPc extracelular para el que la función de la vía glutamato-NO-GMPc es óptima. Para concentraciones menores o mayores la función de la vía es menor. En ratas hiperamonémicas, la adición de concentraciones bajas de GMPc extracelular induce un mecanismo que activa la vía mientras que concentraciones altas la inhiben. La adición de GMPc extracelular induce los mecanismos de activación o de inhibición de la vía dependiendo de los niveles de GMPc extracelular alcanzados, la activan si están por debajo de la concentración óptima y la inhiben si están por encima. Para profundizar en los mecanismos de regulación de la vía Glu-No-GMPc por GMPc extracelular, utilizamos cortes de cerebelo. La adición de GMPc extracelular recupera la función de la vía en hiperamonemia (i) disminuyendo la actividad de la CaMKII y (ii) aumentado la actividad de la NOS. En cortes de ratas control la adición de GMPc extracelular disminuye la función de la vía aumentando (i) la actividad de la CaMKII y (ii) la fosforilación de la NOS en la Ser847, disminuyendo así su actividad. Estos efectos del GMPc extracelular sobre la NOS podrían ser mediados por inhibición de una ecto ó exo proteín-quinasa A (PKA) en cerebelo. El GMPc extracelular disminuye la fosforilación de una proteína de membrana de Mr ≈40 KDa. Ésta podría ser la molécula que media los efectos del GMPc extracelular sobre la señalización intracelular en la vía glutamato-NO-GMPc.The ability to learn a conditional discrimination task in a Y maze is decreased in animal models of hyperammonemia and hepatic encephalopathy. Chronic intracerebral infusion of (extracellular) cGMP using osmotic pumps restores learning ability in the Y maze in rats with chronic hyperammonemia. The mechanism by which extracellular cGMP modulates learning ability is not known. The glutamate (Glu) - nitric oxide (NO) - cGMP pathway modulates learning ability in the Y maze. The function of this pathway is impaired in animal models of hyperammonemia and hepatic encephalopathy, leading to reduced learning ability in the Y maze. As chronic treatment with extracellular cGMP restores learning ability in this task, it is possible that extracellular cGMP restore learning ability by restoring the function of the Glu-NO-cGMP pathway in cerebellum. The overall objective was to study whether extracellular cGMP modulates the function of the Glu- NO -cGMP pathway in cerebellum in vivo as assessed by microdialysis in freely moving rats. To analyze in detail the mechanisms of pathway modulation by extracellular cGMP we used ex vivo cerebellar slices from control and hyperammonemic rats. The results show that chronic intracerebral treatment with extracellular cGMP restores motor activity in hyperammonemic rats and this could be a consequence of reduced neuroinflammation. Extracellular cGMP restores motor coordination because it normalizes the levels of extracellular GABA in cerebellum. It restores also (i) reference memory and learning index but not the working memory in the radial maze and (ii) the spatial learning in the Morris water maze. Both normalization of cGMP levels and the reduction of neuroinflammation in hippocampus by extracellular cGMP may contribute to restore spatial learning. There is an optimal range of extracellular cGMP concentration for the function of the glutamate-NO-cGMP pathway. Lower or higher concentrations reduce the pathway function. In hyperammonemic rats, the addition of low concentrations of extracellular cGMP activates a mechanism that enhances the function of the pathway, while higher concentrations inhibit it. In hyperammonemic rats, addition of extracellular cGMP induces activation or inhibition of the pathway depending on the extracellular cGMP levels achieved, activating it when cGMP is below the optimum concentration and inhibiting if it is above. To further explore the mechanisms of regulation of the Glu-No-cGMP pathway by extracellular cGMP, we used cerebellar slices. Addition of extracellular cGMP restores the function of the pathway in hyperammonemia by (i) decreasing the activity of CaMKII and (ii) increasing the activity of nitric oxide synthase (NOS). Addition of extracellular cGMP in control rats decreases the pathway function by increasing: (i) the activity of CaMKII and (ii) the phosphorylation of the Ser847 NOS, thus decreasing their activity. These effects of extracellular cGMP on NOS may be mediated by an inhibition of exo or ecto protein kinase A (PKA) in cerebellum. Extracellular cGMP reduces phosphorylation of a membrane protein with a MW ≈ 40 kDa. This protein could be the molecule which mediates the effects of extracellular cGMP on intracellular signaling in the glutamate-NO-cGMP pathway