Study of population dynamics of bacteria associated with pine wood nematode after inoculation with different strains of Bursaphelenchus xylophilus in maritime pine (Pinus pinaster)

Abstract

Durante algum tempo pensou-se que o Bursaphelenchus xylophilus era o único agente etiológico da doença do nemátode da madeira do pinheiro. Recentemente, descobriu-se que existem bactérias associadas ao nemátode que contribuem para a patogénese desta doença, sobretudo através da libertação de toxinas que promovem a morte dos pinheiros. De entre as espécies mais comummente encontradas estão bactérias pertencentes aos géneros Bacillus, Pantoea, Pseudomonas e Xanthomonas. Este trabalho teve como principal objectivo o estudo do efeito da inoculação de pinheiro bravo (Pinus pinaster) com quatro isolados diferentes de nemátodes, na população bacteriana dos nemátodes e das árvores, em diferentes fases da progressão da doença. A monitorização da progressão dos sintomas da doença foi igualmente registada. Pretendeu-se também identificar as bactérias isoladas do xilema das árvores e da superfície dos nemátodes através de métodos de identificação clássicos, do sistema de identificação API20E e da sequenciação de ADN bacteriano. Os resultados obtidos demonstraram que, relativamente à progressão dos sintomas da doença, a diferença mais marcante foi verificada para os pinheiros inoculados com o isolado não virulento C14-5, onde se visualizou um agravamento de sintomas mais lento e menos severo do que nos pinheiros inoculados com os isolados virulentos. Verificou-se que numa fase inicial da doença, no geral, a população bacteriana dos ramos inoculados foi menor do que a que foi verificada passados 7 e passados 14 dias de inoculação. Num dos métodos de quantificação foi recuperado um maior número de bactérias nos pinheiros inoculados do que nos controlos aos 7º e ao 14º dias de inoculação. Os isolados que levaram à obtenção de maior quantidade bacteriana foram o HF e o 20, sendo que, comparativamente, o isolado não virulento levou à obtenção de menor quantidade bacteriana. Relativamente à identificação bacteriana, concluiu-se que o sistema API20E não foi suficiente na identificação das espécies bacterianas isoladas, mostrando-se pouco discriminatório, tendo sido identificada a espécie Enterobacter cloacae em 79% dos isolados e não sendo possível a identificação de sete colónias bacterianas. Assim, a adopção de métodos moleculares de identificação, através da sequenciação do ADN bacteriano, permitiu uma identificação mais fiável, tendo sido identificadas onze espécies bacterianas diferentes dentro dos géneros Klebsiella, Bacillus, Enterobacter, Paenibacillus, Terribacillus, Citrobacter, Pantoea e Escherichia. No geral, a diversidade bacteriana aumentou ao longo da progressão da doença. A espécie Bacillus spp. predominou na fase mais precoce da doença e a espécie Klebsiella oxytoca nas fases mais tardias. As espécies bacterianas isoladas da superfície dos nemátodes não diferiram muito das isoladas do xilema dos pinheiros. Neste trabalho foram identificadas espécies bacterianas nunca antes reportadas neste tipo de estudo, podendo estas estar associadas a Portugal. A espécie de pinheiro utilizada neste estudo foi diferente das que são usualmente utilizadas no Japão e na China. Foi a primeira vez que foram isoladas e identificadas bactérias de um isolado não virulento do nemátode da madeira do pinheiro.For a long time it was thought that Bursaphelenchus xylophilus was the only agent of the pine wilt disease. Recently, it was discovered that there are bacteria associated with the nematodes that contribute to the pathogenesis of this disease, mainly through the release of toxins that promote the death of the pines. Among the species most commonly found, are bacteria belonging to the Bacillus, Pantoea, Pseudomonas and Xanthomonas genera. The main objective of this work was to study the effect of inoculation of maritime pine (Pinus pinaster) with four different nematode isolates, in the bacterial population of nematodes and trees, at different stages of disease progression. The monitoring of progression of disease symptoms was also recorded. Also, the identification of bacteria isolated from the xylem of trees and the surface of nematodes was performed by classical identification methods, by identification system API20E and by sequencing of bacterial DNA. The results showed that for the symptoms progression, the most striking difference was observed for the pines inoculated with the avirulent isolate, C14-5, which led to a slower and less severe aggravation of symptoms than in pines inoculated with the virulent isolates. It was found that at an earlier stage of the disease, in general, bacterial population of inoculated twigs was lower than what was observed 7 and 14 days after inoculation. In one of the quantification methods more bacteria were recovered from the inoculated pines than from the control pines on the 7th and 14th days after inoculation. A bigger bacterial quantity was isolated from pines inoculated with the nematode isolates HF and 20, and, comparatively, few bacteria were isolated from pines inoculated with the avirulent isolate. The identification system API20E proved to be insufficient and poorly discriminatory in the identification of bacterial species; Enterobacter cloacae species was identified in 79% of the isolated bacterial colonies and seven of these colonies couldn’t be identified by this method. Thus, the adoption of identification molecular methods, through bacterial DNA sequencing, allowed a more reliable identification: eleven different bacterial species within the Bacillus, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Paenibacillus, Pantoea and Terribacillus genera were identified. General bacterial diversity increased with the progression of the disease. Bacillus spp. species were predominant at the earlier stage of disease progression and Klebsiella oxytoca species at the later stages. Bacterial species isolated from the surface of nematodes were similar to those isolated from the xylem of pines. In the present work new bacterial species were identified which have never been reported before in this type of study and may be associated with Portugal. P. pinaster, the pine species used in this study, was different from those commonly grown in Japan and China. Furthermore, it was the first time that bacteria were isolated and identified from an avirulent pine wood nematode isolate