Objetivo: Este estudo apresenta a primeira descrição do isolamento de H. pullorum em amostras de carne de frango crua, revelando o importante papel da metodologia de Sequenciação Total do Genoma
para a correta identificação e caracterização das estirpes isolada

Correia, Cristina Belo

Gomes, João Paulo

Oleastro, Mónica

Sampaio, Daniel A.

Santos, Andrea

Saraiva, Margarida

Vieira, Luís

Vítor, Borges

Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

09_IntroduçãoA carne e os produtos à base de carne são importantes fontes de infeções intestinais nos humanos. Entre os agentes patogénicos intestinais mais comuns destacam-se as bactérias Salmonella enterica, Campylobacter spp. e Escherichia col i enterohemorrá-gica ou produtora de verotoxinas (EHEC ou VTEC). No entanto, as infeções entéricas podem também ser causadas por algumas es-pécies do género Helicobacter spp., nomeadamente a bactéria de Gram negativo Helicobacter pul lorum. Esta tem sido deteta-da quer em aves domésticas, quer em amostras humanas (1,2). Em particular, destacam-se o seu isolamento de carcaças de aves domésticas (possivelmente devido à contaminação durante os processos de abate) e a sua associação com casos de gastro-enterite (1) ou de doença inflamatória crónica do intestino ou do fígado no Homem (3).Neste sentido, a bactéria H. pullorum tem sido apontada como um agente patogénico emergente causador de doenças transmitidas por alimentos (2,4-6). No entanto, a falta de métodos para a dete-ção de H. pullorum e as dificuldades associadas à sua cultura têm provavelmente resultado no subdiagnóstico das infeções associa-das. Por outro lado, até hoje, apenas foi sequenciado o genoma de uma estirpe de H. pullorum (7), pelo que o conhecimento das ca-racterísticas genéticas potencialmente mediadoras de adaptação ou virulência deste agente patogénico emergente é ainda limitado._ObjetivoEste estudo apresenta a primeira descrição do isolamento de H. pullorum em amostras de carne de frango crua, revelando o im-portante papel da metodologia de Sequenciação Total do Genoma para a correta identificação e caracterização das estirpes isoladas. _Materiais e métodosAmostras alimentares, isolamento, identificação e teste de suscetibilidade a antimicrobianosNo âmbito do Plano de Inspeção dos Géneros Alimentícios (PIGA) da Direcção-Geral de Alimentação e Veterinária, foram colhidas amostras de carne de 15 diferentes produtores. As amostras fo-ram sujeitas a: i) pré-enriquecimento seguindo as orientações pre-conizadas na ISO 10272-1:2006; ii) incubação a 37±1ºC durante 4 a 6h, seguida de 44±4h a 41.5±1ºC em condições microaerófilas com hidrogénio (AnoxomatTM, MART Microbiology BV, Brachten, Holanda); iii) f filtração com membrana de celulose (0.65µm); e iv) cultura em agar Columbia, enriquecido com sangue de ovelha a 5% (bioMérieux, Marcy l’Étoile, França). Posteriormente, através de subcultura em placas de gelose de sangue, selecionaram-se colónias de bacilos com forma espiralada, de Gram negativo e oxi-dase positivos. Colónias não características de Campylobacter spp. foram identificadas como H. pullorum através de PCR e se-quenciação de Sanger do gene que codifica o 16S rRNA, usando oligonucléotidos universais (8,9). Procedeu-se ao teste de susceti-bilidade a antimicrobianos, determinando a concentração mínima inibitória (CMI) de três antibióticos (ciprofloxacina, eritromicina e tetraciclina) através do método E-test.Sequenciação Total do Genoma e análises de genómica comparativaApós extração, o DNA das estirpes de H. pul lorum isola-das no presente estudo foi sujeito à técnica de Sequenciação Total do Genoma no equipamento MiSeq (Illumina) dispo-nível no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA). O genoma das estirpes foi obtido através da montagem bioinformática das sequências geradas (usando o softwa-re Velvet), tendo-se usado profundidades de cobertura entre  _ Isolamento de Helicobacter pullorum de carne de frango: características de um patogénio emergente de origem alimentar  Vítor Borges1, Andrea Santos 2, Cristina Belo Correia3,  Margarida Saraiva 3, Luís Vieira4, Daniel A. Sampaio 4, João Paulo Gomes1, Mónica Oleastro 2monica.oleastro@insa.min-saude.pt(1) Núcleo de Bioinformática; (2) Laboratório Nacional de Referência de Infeções Gastrintestinais. Departamento de Doenças Infeciosas, INSA.(3) Unidade de Referência. Departamento de Alimentação e Nutrição, INSA.(4) Unidade de Tecnologia e Inovação. Departamento de Genética Humana, INSA.artigos breves_   n. 4 _Sequenciação de Nova GeraçãoDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológico2ª série2015especial 6númeroInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP_Doenças Infeciosaswww.insa.pt10135x e 195x. Por forma a obter uma visão detalhada da diversida-de genética entre estirpes de H. pullorum, realizaram-se múltiplas análises bioinformáticas de comparação genómica usando as se-quências obtidas, bem como a sequência do único genoma de H. pullorum (estirpe MIT 98-5489) disponível até à data (7). _Resultados e discussãoO presente estudo constitui a primeira descrição do isolamento de H. pullorum em amostras de carne de frango crua. Foram isoladas estirpes de H. pullorum de quatro das 17 amostras analisadas. Três estirpes foram obtidas de carcaças de frango refrigeradas, e a quarta estirpe foi isolada de uma preparação de carne crua de frango temperada (tabela 1). Estes resultados sugerem que a bacté-ria H. pullorum poderá ser transmitida por alimentos, e apresenta risco de transmissão zoonótica, tal como sucede com Campylobac-ter spp., atualmente o principal agente bacteriano enteropatogénico para o Homem a nível mundial. Por outro lado, demonstrou-se a efi-cácia da aplicação de um método de filtração com membrana para o isolamento de H. pullorum a partir de amostras de carne. Este dado é relevante uma vez que se considera que as dificuldades de cultura deste microrganismo fastidioso e o uso inapropriado de meios e condições de cultura têm levado à subdetecção, e consequente subvalorização de H. pullorum como um agente patogénico.As estirpes isoladas foram sujeitas a testes de suscetibilidade aos antibióticos comummente usados para tratar infeções causadaspor Campylobacter e Hel icobacter. Todas as estirpes mostraram ser resistentes à ciprofloxacina, uma estirpe foi também resisten-te à eritromicina, e outra à tetraciclina (tabela 1). Foi possível as-sociar os fenótipos de resistência à ciprofloxacina, eritromicina e tetraciclina a mutações genéticas nos genes gyrA, 23S rRNA e 16S rRNA, respetivamente, tal como previamente descrito (7,10). Excecionalmente, a mutação no gene gyrA que confere resistên-cia à ciprofloxacina não foi detetada numa estirpe resistente a este antibiótico. A pesquisa de mutações em outros alvos gené-ticos, como o gene gyrB, foi inconclusiva, pelo que é expectável que a base molecular de resistência envolva outros mecanismos (ex. bombas de efluxo), tal como demonstrado para Campylo-bacter spp. (11). De um modo geral, embora não estejam descri-tos estudos de suscetibilidade a antimicrobianos incluindo um número alargado de isolados de H. pul lorum, o presente estudo, bem como os de outros autores (10,12) apontam para a impor-tância da avaliação do perf il de resistência do agente patogéni-co emergente H. pul lorum. Este estudo permitiu ainda libertar e analisar quatro novos genomas de estirpes de H. pullorum (até à data estava apenas disponível o genoma de uma estirpe - MIT 98-5489 (7) ). O tamanho do genomas das estirpes isoladas variou entre 1.7 e 2.1 Mb (tabela 1), revelan-do elevada similaridade (>98%) nas regiões genómicas comuns, mas sendo pautado por regiões genómicas muito polimórficas. Destacam-se um gene que codifica para uma proteína da membra-na externa (PME), potencialmente com importantes propriedades antigénicas (13), e um gene que codifica uma potencial citotoxinaartigos breves_   n. 4Tabela 1:      Origem, tamanho do genoma e perfil de suscetibilidade a antimicrobianos das quatro estirpes de   H. pullorum isoladas de amostras de carne de frango crua.229313/12229334/12229336/12229254/12Carcaça de frango refr igeradaPreparação de carne crua de frango temperadaCarcaça de frango refr igeradaCarcaça de frango refr igerada1.692.131.811.81>32 (R )>32 (R )>32 (R )>32 (R )0.250.125>256 (R )0.250.250.50.38>256 (R )Estirpe Origem Tamanho do genoma (Mb)Ciprofloxacina Eritromicina TetraciclinaSuscetibilidade a antimicrobianos (Concentração Mínima Inibitória em mg/L; R - resistente )Doutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológico2ª série2015especial 6númeroInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP_Doenças Infeciosaswww.insa.pt11com padrões estruturais semelhantes ao da citotoxina vacuolizan-te do agente patogénico gástrico H. pylori. Quer a PME, pelo seu potencial envolvimento em variação antigénica, quer esta poten-cial citotoxina, poderão contribuir para a virulência e capacidade de adaptação de H. pullorum, pelo que constituem alvos de estu-do promissores.Entre as regiões genómicas não partilhadas por todas as estirpes inclui-se um cluster de genes que codificam o sistema de secre-ção do tipo VI (SST6). Este sistema é utilizado pelas bactérias de Gram negativo para “injeção” de proteínas nas células eucariotas alvo com vista à sua manipulação (14), constituindo um reconhe-cido mecanismo de virulência. Por exemplo, em C. jejuni tem-se associado a infeção com estirpes que possuem o SST6 com uma apresentação gastrintestinal mais severa (15, 16)._ConclusãoOs dados apresentados indicam que o agente patogénico emer-gente H. pullorum poderá ser transmitido aos humanos através do contacto/consumo de carne, pelo que se sugere a expansão das estratégias de vigilância dos produtos alimentares. Adicional-mente, através da aplicação da tecnologia de Sequenciação Total do Genoma, foi possível incrementar o nosso conhecimento sobre a variabilidade entre estirpes de H. pullorum, tendo-se apontado várias características genéticas potencialmente mediadoras de vi-rulência e adaptação.Este artigo corresponde a uma versão reduzida em português do artigo: Borges V, Santos A, Correia CB, et al. Helicobacter pullorum isolated from fresh chicken meat: antibiotic resistance and genomic traits of an emerging foodborne pathogen. Appl Environ Microbiol. 2015 Dec 1;81(23):8155-63.artigos breves_   n. 4Referências bibliográficas:(1) Steinbrueckner B, Haer ter G, Pelz K, et al. Isolation of Helicobacter pullorum from patients with enteritis. Scand J Infect Dis. 1997;29(3):315-8. (2) Ceelen L, Decostere A, Verschraegen G, et al. Prevalence of Helicobacter pullorum among patients with gastrointestinal disease and cl inical ly healthy persons. 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Isolamento de Helicobacter pullorum de carne de frango: características de um patogénio emergente de origem alimentar

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