Este trabalho teve como objetivo estudar a variabilidade genética e
o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos de estirpes de C. difficile
recebidas no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge
(INSA) entre julho de 2012 e dezembro de 2014

Isidro, Joana

Júlio, Cláudia

Oleastro, Mónica

Santos, Andrea

Scientific Repository of the National Health Institute Doutor Ricardo Jorge

Clostridium difficile: diversidade genética e perfis de suscetibilidade aos antimicrobianos

Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

15_IntroduçãoA infeção por Clostridium dif f icile é descrita como a principal cau-sa de diarreia relacionada com a prestação de cuidados de saúde em países desenvolvidos (1). As manifestações clínicas da doença são variadas e vão desde a diarreia ligeira a complicações graves e muitas vezes fatais, como é exemplo a colite pseudomembrano-sa (2). A infeção por C. dif f icile está diretamente associada à toma recente de antibióticos, que desequilibram a flora intestinal, crian-do assim condições favoráveis à multiplicação desta bactéria toxi-nogénica.Em 2004 surgiu um novo tipo genético (ribotipo) de C. dif f ici le, o ribotipo 027, caracterizado pela elevada resistência às fluoroqui-nolonas, e que foi responsável por inúmeros surtos em vários pa-íses europeus, incluindo Portugal (3, 4). Para além do ambiente hospitalar, C. dif f icile tem sido isolado de amostras provenientes de animais domésticos, colonizados ou in-fetados, e em produtos alimentares de origem animal (5). Estirpes geneticamente semelhantes a estas foram também isoladas no ho-mem, nomeadamente os ribotipos 078, 014 e 001 (5). A virulência da bactéria C. dif f icile é mediada pela produção em si-multâneo de duas toxinas, a enterotoxina A e a citotoxina B, ambas codificadas por genes do locus de patogenicidade e cuja expres-são é regulada pelo gene tcdC. Polimorfismos neste gene estão associadas a maiores níveis de produção de toxinas (6). Para além destas duas toxinas, algumas estirpes produzem a toxina binária, cuja função ainda não está totalmente estabelecida, mas que pa-rece promover a adesão da bactéria às células do cólon (7). A terapia antimicrobiana utilizada no tratamento desta infeção bac-teriana tem-se mantido praticamente inalterada, sendo o metro-nidazol e a vancomicina os antibióticos de primeira linha, com a vancomicina como primeira escolha nos casos mais graves (2). _ObjetivoEste trabalho teve como objetivo estudar a variabilidade genética e o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos de estirpes de C. di-fficile recebidas no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jor-ge (INSA) entre julho de 2012 e dezembro de 2014._Materiais e métodosParticiparam no estudo 19 hospitais distribuídos pelas 5 regiões de Portugal Continental, que enviaram ao INSA amostras de fezes ou estirpes de C. dif f ici le isoladas de doentes internados, com um quadro clínico de diarreia.As estirpes foram caracterizadas a nível molecular relativamente à presença dos genes das toxinas A, B e binária, presença de muta-ções no gene regulador das toxinas (tcdC ) e ribotipo. Foi também avaliada a presença do gene ermB, marcador da resistência aos MLSB, macrólidos, lincosamidas e estreptograminas do tipo B. A suscetibilidade aos antimicrobianos foi testada por E-test para a moxifloxacina, vancomicina, metronidazol e imipenem, sendo definida por concentrações mínimas inibitórias (CMI) de >4 mg/L, >2mg/L, >2mg/L e ≥16mg/L, respetivamente (EUCAST 2014)._ResultadosDesde julho de 2012 até dezembro de 2014 foram estudadas 185 estirpes de C. dif f icile: 31 estirpes provenientes de 3 hospitais da região Norte; 83 estirpes de 5 hospitais da região Centro; 63 estir-pes de 8 hospitais da região de Lisboa e Vale do Tejo; uma estirpe de um hospital no Alentejo e 7 estirpes provenientes de 2 hospitais do Algarve.Observou-se uma grande variabilidade genética entre as 185 es-tirpes de C. dif f ici le estudadas, com 64 ribotipos identificados. O ribotipo hipervirulento 027 foi o mais frequente, sendo respon-sável por 22,0% (40/185) do total de casos isolados, constituin-_Clostridium difficile: diversidade genética e perfis de suscetibilidade aos antimicrobianos  Andrea Santos, Joana Isidro, Cláudia Júlio, Mónica Oleastro  monica.oleatro@insa.min-saude.ptLaboratório Nacional de Infeções Gastrintestinais.  Departamento de Doenças Infeciosas, INSA.artigos breves_   n. 5 _TDoenças InfeciosasInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero1116do 34,9% (29/83) dos casos internados nos 5 hospitais da região Centro, 14,3% (9/63) dos casos provenientes dos 8 hospitais da região de Lisboa e Vale do Tejo e 25,0% (2/8) dos casos identifica-dos nos 3 hospitais das regiões do Alentejo e Algarve. Este riboti-po não foi detetado em nenhum dos 3 hospitais da região Norte.Para além do ribotipo 027, os ribotipos mais frequentes foram 020, 014 (6% cada) e os ribotipos 017, 078 e 203 (4% cada) (gráfico 1). Do total das estirpes analisadas, 95,1% (176/185) eram toxinogé-nicas, sendo 88,6% (164/185) positivas para ambas as toxinas A e B, 6,5% (12/185) positivas apenas para a toxina B (toxA-/toxB+) e 4,3% (8/185) negativas (gráfico 2). Acrescente-se que 58,3% (7/12) das estirpes com o fenótipo toxA-/toxB+ pertenciam ao ribotipo 017. Das 185 estirpes de C. dif f icile, 54 (29,2%) eram ainda positi-vas para a toxina binária (gráfico 2), das quais 70,4% (38/54) per-tenciam ao ribotipo 027. Em 31,4% (58/185) das estirpes estudadas foram identificados po-limorfismos no gene tcdC, regulador negativo da produção das to-xinas A e B. Apesar de a maioria (69%; 40/58) pertencer ao ribotipo 027, também foram detetadas mutações noutros ribotipos emer-gentes, tais como os ribotipos 176, 078, 438 e 126. Em relação às resistências aos antimicrobianos, globalmente, de-tetou-se uma frequência de estirpes resistentes à moxifloxacina de 34,1% (63/185). Em relação ao imipenem a frequência de resistên-cia foi de 64,9% (24/37), da qual 29,8% (11/37) corresponde a ho-moresistência e 35,1% (13/37) a heteroresistência (gráfico 3). Para a moxifloxacina foi observada uma CMI 50 de 2.0mg/L e CMI 90 > 32mg/L, enquanto que para o imipenem verificou-se uma CMI 50 > 32mg/L e CMI 90 > 32mg/L, incluindo heteroresistências. A frequência de estirpes resistentes ao metronidazol e à vancomi-cina foi de 7,1% (13/183) e 1,7% (3/183) respetivamente (gráfico 3), sendo as CMI50 de 0,38mg/L e CMI 90 de 1,5mg/L para o metroni-dazol e CMI50 de 0,75mg/L e CMI 90 de 1mg/L para a vancomicina. artigos breves_   n. 5027(40/22)014(11/6) 020(11/6)017(7/4)078(7/4)203(7/4)500(6/3)449(4/2)046(4/2)Outros(88/47)Gráfico 1:      Distribuição das 185 estirpes de Clostridium difficile por ribotipo.Gráfico 2:      Distribuição das 185 estirpes de Clostridium difficile quanto à presença dos genes das toxinas A, B e toxina binária.Gráfico 3:      Suscetibilidade aos antimicrobianos das estirpes de Clostridium difficile.88,66,5 4,329,20102030405060708090100toxA+/toxB+ toxA-/toxB+ toxA-/toxB- tox binária +%34,17,165,998,4 92,935,135,129,81,6HomoresistênciaHeteroresistênciaResistenteSensível020406080100120Moxif loxacinan=185 n=183 n=183 n=37Vancomicina Metronidazol Imipenem%( n /% )Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero1117artigos breves_   n. 5www.insa.ptComparando as resistências do ribotipo 027 com os outros ribo-tipos, aquele apresentou uma resistência mais elevada à moxiflo-xacina e uma suscetibilidade reduzida ao metronidazol, sendo a diferença para as CMI50 e CMI90 entre os dois grupos significati-va (Pt-student <0,05) (tabela 1). A suscetibilidade à vancomicina foi idêntica para o ribotipo 027 e restantes ribotipos (tabela 1). O gene ermB, associado à resistência à clindamicina, foi identifica-do em 11,5% (21/182) do total de estirpes de C. difficile analisadas. Destas 21 estirpes, 5 (23,8%) apresentaram resistência simultânea à moxifloxacina e imipenem, sendo que 4 pertenciam ao ribotipo 017. _Discussão e conclusãoC. dif f ici le é uma bactéria Gram positiva, formadora de esporos, anaeróbia estrita frequentemente implicada em casos de diar-reia nosocomial. A infeção é causada por estirpes toxinogénicas, embora existam naturalmente estirpes não produtoras de toxinas, capazes de colonizar os seus hospedeiros. Em Portugal, os dados epidemiológicos referentes a esta infeção são escassos, embora nos últimos anos tenha existido um esforço de várias entidades para que seja melhor conhecida a distribuição nacional da infeção por C. dif f icile. Este trabalho é um contributo para esse conhecimento, tendo em conta a amostra de conveniên-cia dos hospitais envolvidos, assente naqueles que, durante perí-odos de tempo diferentes, voluntariamente aceitaram participar no estudo. A grande variabilidade genética de estirpes de C. difficile encontra-da numa mesma unidade hospitalar, fora de um contexto de surto, é comum, sugerindo quer infeção hospitalar quer comunitária. Em con-trapartida, o predomínio de um único ribotipo numa mesma unidade hospitalar, sugere uma origem nosocomial da infeção por C. difficile, normalmente associada a estirpes mais resistentes e, consequente-mente, com elevada capacidade de disseminação em meio hospi-talar, como pode ser exemplo o ribotipo 027, identificado na região centro do país. De acordo com a literatura, a elevada prevalência de ribotipos mais virulentos e resistentes pode ter uma implicação direta na taxa de incidência da infeção por C. difficile (8).Para além do ribotipo 027, outros genótipos têm emergido ultima-mente na Europa, como é o caso dos ribotipos 017 e 078, também encontrados neste estudo. Relativamente ao ribotipo 017, apesar de apenas produzir a toxina B, tem sido recentemente associado a vários surtos, com uma amplitude mundial, bem como a doença severa e elevada letalidade, o que evidencia bem a virulência deste ribotipo (9,10). Acresce ainda a elevada resistência do ribotipo 017 a vários antibióticos em simultâneo, como as fluoroquinolonas, clin-damicina e imipenem, antibióticos geralmente implicados na pres-são seletiva e consequente disseminação de estirpes resistentes. Embora a maioria dos isolados clínicos seja habitualmente sensível aos antibióticos utilizados no tratamento da infeção por C. dif ficile, tem-se vindo a registar um aumento de casos refratários à terapêu-tica com estes antibióticos, sobretudo ao metronidazol (11). Também já foram descritas estirpes de C. dif ficile com suscetibilidade dimi-nuída ao metronidazol e à vancomicina, no entanto ainda não foi possível estabelecer uma correlação entre o fenótipo de resistência da estirpe e a falência terapêutica.Em conclusão, a elevada frequência de ribotipos mais virulentos e emergentes detetada neste estudo, aliada à elevada taxa de re-Tabela 1:      Comparação da suscetibilidade aos antimicrobianos entre o ribotipo 027 e os restantes ribotipos.CMI: concentração mínima inibitória           * Diferença signif icativa entre concentrações mínimas inibitórias (Pt-student <0,05)Moxifloxacina VancomicinaRibotipo 027  (n=40)Outros Ribotipos  (n=145)CMI 50*>321,5CMI 90*>323Intervalo CMI>320,38->32CMI 500,750,75CMI 9011,5Intervalo CMI0,19-2,00,125-3,0CMI 50*1,50,25CMI 90*31Intervalo CMI<0,016-16<0,016-6,0MetronidazolInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológico.i . t2ª sérienúmero1118artigos breves_   n. 5sistência aos antimicrobianos, pode antecipar uma rápida disse-minação destas estirpes em ambiente hospitalar, evidenciando a necessidade de implementação de um sistema de vigilância ativo da infeção por C. dif f ici le em Portugal.AgradecimentosAos laboratórios de patologia clínica dos hospitais participantes: Centro Hospitalar de Coimbra, Centro Hospitalar de Vila Conde, Centro Hospi-talar do Algarve, Centro Hospitalar do Oeste, Centro Hospitalar Lisboa Central, Hospitais da Universidade de Coimbra, Hospital Beatriz Ângelo, Hospital da Guarda, Hospital de Aveiro, Hospital de Braga, Hospital de Cascais, Hospital de Cova da Beira, Hospital de Santarém, Hospital de Viana do Castelo, Hospital de Vila Franca, Hospital do Baixo Alentejo, Hospital Garcia de Orta, Hospital Prof. Doutor Fernando Fonseca.À doutora Cristina Furtado pela revisão científica do artigo.Referências bibliográficas:(1) Rupnik M, Wilcox MH, Gerding DN. Clostridium dif f ici le infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nat Rev Microbiol. 2009; 7(7):526-36.(2) Debast SB, Bauer MP, Kuijper EJ; European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the treatment guidance document for Clostridium dif f icile infection. Clin Microbiol Infect. 2014;20(Suppl 2):1-26. (3) He M, Miyajima F, Roberts P, et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostr idium dif f ici le. Nat Genet. 2013;45(1):109-13. Epub 2012 Dec 9.(4) Oleastro M, Coelho M, Gião M, et al. Outbreak of Clostr idium dif f ici le PCR ribotype 027-the recent experience of a regional hospital. BMC Infect Dis. 2014;14:209. (5) Freeman J, Bauer MP, Baines SD, et al. The changing epidemiology of Clostr idium dif f ici le infections. Clin Microbiol Rev. 2010;23(3):529-49. (6) Hunt JJ, Ballard JD. Variations in virulence and molecular biology among emerging strains of Clostr idium dif f ici le. Microbiol Mol Biol Rev. 2013;77(4):567-81.(7) Gerding DN, Johnson S, Rupnik M, et al. Clostr idium dif f ici le binary toxin CDT: mechanism, epidemiology, and potential cl inical importance. Gut Microbes. 2014;5(1):15-27. Epub 2013 Oct 31.(8) Davies KA, Longshaw CM, Davis GL, et al. Underdiagnosis of Clostridium dif f icile across Europe: the European, multicentre, prospective, biannual, point-prevalence study of Clostridium dif f icile infection in hospitalised patients with diarrhoea (EUCLID). Lancet Infect Dis. 2014;14(12):1208-19.(9) Arvand M, Hauri AM, Zaiss NH, et al. Clostridium dif ficile ribotypes 001, 017, and 027 are associated with lethal C. dif ficile infection in Hesse, Germany. Euro Surveill. 2009;14(45). pii: 19403.(10) Collins DA, Hawkey PM, Riley TV. Epidemiology of Clostridium dif f icile infection in Asia. Antimicrob Resist Infect Control. 2013;2(1):21.(11) Pepin J, Alary ME, Valiquette L, et al. Increasing r isk of relapse af ter treatment of Clostr idium dif f ici le colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 2005;40(11):1591-7.Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt2ª sérienúmero11LINKLINKLINKLINKLINKLINKLINKLINK

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