Este estudo foi parcialmente financiado pela FCT: PEst-OE/SAU/UI0009/2011

Faustino, Paula

Gomes, Susana

Gonçalves, João

Loureiro, Pedro

Pita, Lina

Silva, Bruno

Scientific Repository of the National Health Institute Doutor Ricardo Jorge

Variantes genéticas da hormona hepcidina contribuem para aumentar os níveis da ferritina sérica em indivíduos suscetíveis de desenvolverem sobrecarga em ferro

Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

06_IntroduçãoUma das principais causas da acumulação progressiva e patoló-gica de ferro no organismo tem base genética e é devida a um ex-cesso de absorção, ao nível do duodeno, do ferro proveniente da alimentação e ao aumento da sua libertação pelos macrófagos. Esta patologia, denominada hemocromatose hereditária (HH), está normalmente associada à presença, em homozigotia, da mutação C282Y (c.845G>A) no gene HFE. Existem ainda variantes comuns deste gene, como a H63D (c.187C>G), cuja frequência alélica na população portuguesa é de 15 a 20% (1), que também podem ser encontradas em casos de sobrecarga em ferro (2).  A HH é uma doença de baixa penetrância e expressividade variável. Para a grande variabilidade do fenótipo contribuem fatores ambien-tais (tais como o álcool, a hepatite, etc.) e fatores genéticos, nomea-damente a presença de variantes genéticas em genes relacionados com o metabolismo do ferro. É o caso da hepcidina (codificada pelo gene HAMP ), uma hormona hepática que desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase do ferro pois, consoante as necessidades do organismo, modula a absorção de ferro pelo intestino assim como a sua libertação pelos macrófagos e células de armazenamento. Os níveis baixos desta hormona são reconhecidos como a principal causa da sobrecarga de ferro obser-vada na HH. Assim, foi sugerido que fatores genéticos que levem à diminuição da expressão do gene HAMP poderão contribuir para o agravamento dos fenótipos de sobrecarga em ferro (3,4,5). _ObjetivoSendo a hepcidina a principal hormona reguladora da homeosta-se do ferro, pretendeu-se, neste trabalho, investigar se variantes comuns na região regulatória do gene HAMP (promotor), podem influenciar os níveis de ferritina sérica nos indivíduos que possuem a variante H63D no gene HFE._Materiais e métodosParticipantes: 100 indivíduos com níveis de ferritina sérica (sFt) <300 µg/L e sem alterações no gene HFE (Tabela 1, grupo controlo); 91 indivíduos com níveis de sFt <300 µg/L e portadores da variante H63D no gene HFE em heterozigotia (HD) ou em homozigotia (DD) (Tabela 1, grupo 1); 218 indivíduos com um perfil de sobrecarga em ferro, em particular com níveis de sFt ≥300 µg/L e portadores da variante H63D no gene HFE (HD ou DD) (Tabela 1, grupo 2). De acordo com os critérios clínicos estabelecidos, nenhum indivíduo possuía consumo de álcool em excesso nem infeção pelo vírus da hepatite C. Foi obtido o consentimento informado dos participantes.Genotipagem: a região proximal (1,14 kb) do promotor do gene HAMP foi genotipada para todos os 409 indivíduos, por metodolo-gia de PCR convencional seguida de sequenciação automática. Análise de dados: Os dados foram testados para a normalidade e variância. A análise envolvendo os valores de sFt foi efetuada após transformação logarítmica. A análise ANCOVA foi efetuada utilizando a idade e o género como co-variáveis. A signif icância estatística foi considerada para valores de p<0,05.  _ResultadosA pesquisa de alterações no promotor do gene HAMP levou à identificação de duas variantes, nc.-1010C>T (rs10414846) e nc.-582A>G (rs10421768), que já haviam sido previamente descritas. Dado que nas amostras em estudo estas variantes foram encon-tradas em associação (desequilíbrio de linkage ), apresentando preferencialmente as combinações CA e TG no genoma, as análi-ses subsequentes foram tratadas de acordo com estes haplótipos. Foi determinada a frequência destes haplótipos e a sua possível relação com o nível de sFt, na presença ou ausência da variante H63D no gene HFE (Tabela 2). Foi observado que a frequência do artigos breves_  n. 2_Variantes genéticas da hormona hepcidina contribuem para aumentar os níveis da ferritina sérica em indivíduos suscetíveis de desenvolverem sobrecarga em ferro  Bruno Silva, Lina Pita, Susana Gomes, Pedro Loureiro,  João Gonçalves, Paula Faustino paula.faustino@insa-min-saude.ptDepartamento de Genética Humana, INSA._Doenças GenéticasDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim EpidemiológicoInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPwww.insa.pt201410número2ª série07haplótipo TG é significativamente superior (p=0,029) no grupo de indivíduos portadores da variante H63D no gene HFE e que têm valores de sFt ≥300 µg/L (30,5%, grupo 2) comparativamente com o grupo controlo (21,5%) e com o grupo de indivíduos portadores da variante H63D com sFt <300 µg/L (22,0%, grupo 1; p=0,040).De modo a confirmar a associação observada, dividimos os 218 indivíduos portadores de H63D em 2 grupos, independentemente do seu nível de sFt. Assim, juntaram-se, por um lado os indivíduos com o genótipo CA/CA em HAMP e, por outro lado, os restantes in-divíduos com os genótipos CA/TG e TG/TG (Figura 1). Observámos que neste segundo grupo de indivíduos os valores de sFt são signi-ficativamente superiores (p=0,023; ajustado para idade e género).      artigos breves_   n. 2Figura 1:      Distribuição da ferritina sérica de acordo com os genótipos do promotor do gene HAMP em indivíduos com a variante H63D em HFE. * teste χ 2;   n = número de indivíduos ou alelosAs amostras foram testadas para a normalidade e os valores de p obtidos por análise ANCOVA ajustada para idade e género.a grupo controlo, sem a variante H63D no gene HFE e com valores normais dos parâmetros bioquímicos do metabolismo do ferro;  b indivíduos com a variante H63D em heterozigotia (HD) ou em homozigotia (DD);  c ferritina sérica;  d teste-t [Ft foi testada como log(Ft)]; n = número de indivíduos; valores apresentados como: média [IC 95%] HaplótipoGenótipoVariantes  promotor HAMP c.-1010C>T; c.-582A>GGrupo controloFrequência (%) [n] Frequência (%) [n] p* Frequência (%) [n] p*Grupo 1 Grupo 2CATGCA/CACA/TGTG/TG78,5 [157]21,5 [43]58,0 [58]41,0 [41]1,0 [1]78,0 [142]22,0 [40]62,6 [57]30,8 [28]6,6 [6]0,903<0,0010,029<0,00169,5 [303]30,5 [133]47,7 [104]43,6 [95]8,7 [19]Ferro sérico (µg/dL)Ferritina sérica (µg/L)Saturação da transferrina (%)ParâmetroGrupo controloHFE_wt a[n=100] HFE_HD ou DD b sFtc <300 µg/L[n=91] HFE_HD ou DD b sFtc ≥300 µg/L[n=218]Grupo 1 Grupo 2106,4 [100,1; 112,7]82,2 [67,7; 96,7]30,8 [28,6; 33,1]124,1 [114,4; 133,8]133,6 [114,0; 153,2]39,7 [36,2; 43,2]158,0 [148,8; 167,2]970,4 [876,6; 1075,8]59,0 [55,9; 62,1]<0,001<0,001<0,0010,0030,001<0,001p d p dTabela 1:      Parâmetros bioquímicos do metabolismo do ferro nos grupos de indivíduos estudados, divididos de acordo com a presença/ausência da variante H63D no gene HFE e com os diferentes níveis de ferritina sérica.Tabela 2:      Associação entre os haplótipos do promotor do gene HAMP, a variante H63D e diferentes níveis de ferritina sérica.0500100015002000Genótipo HAMPCA/CA CA/TG; TG/TGp=0,023sFt (µg/L)Doutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim EpidemiológicoInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPwww.insa.pt201410número2ª sérieartigos breves_  n. 208Referências bibliográficas:(1) Cardoso CS, Oliveira P, Porto G, et al. Comparative study of the two more frequent HFE mutations (C282Y and H63D): signif icant dif ferent allelic frequencies between the North and South of Portugal. Eur J Hum Genet. 2001; 9(11):843-8.  (2) Feder JN, Gnirke A, Thomas W, et al. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nat Genet. 1996;13(4): 399-408. (3) Merryweather-Clarke AT, Cadet E, Bomford A, et al. Digenic inheritance of mutations in HAMP and HFE results in dif ferent types of haemochromatosis. Hum Mol Genet. 2003;12(17):2241-7. (4) Jacolot S, Le Gac G, Scotet V, et al. HAMP as a modif ier gene that increases the phenotypic expression of the HFE pC282Y homozygous genotype. Blood. 2004;103(7):2835-40. (5) Aguilar-Martinez P, Giansily-Blaizot M, Bismuth M, et al. HAMP promoter mutation nc.-153C>T in non p.C282Y homozygous patients with iron overload. Haematologica. 2010; 95(4):687-8.(6) Andreani M, Radio FC, Testi M, et al. Association of hepcidin promoter c.-582 A>G variant and iron overload in thalassemia major. Haematologica.2009; 94(9):1293-6.(7) Bruno F, Bonalumi S, Camaschella C, et al. The -582A>G variant of the HAMP promoter is not associated with high serum ferritin levels in normal subjects. Haematologica.2010; 95(5):849-50._Discussão A presença, em homozigotia, da mutação C282Y no gene HFE é re-conhecida como um fator de risco para o desenvolvimento de HH. O mesmo não se verifica para a variante H63D, cujo significado pa-tológico continua por esclarecer. Neste estudo verificámos que o haplótipo TG no promotor do gene HAMP (definido pelas variantes nc.-1010T e nc.-582G) é mais frequente em indivíduos portadores da variante H63D no HFE que apresentam valores mais elevados de sFt. Do mesmo modo, a variante nc.-582A>G já tinha sido des-crita em associação com fenótipos mais graves de sobrecarga em ferro em doentes com beta-talassémia major (6). Por outro lado, não foi observado nenhum efeito da mesma nos parâmetros perifé-ricos do metabolismo do ferro em indivíduos saudáveis (7). Postu-lamos, então, que a variante nc.-582A>G no promotor de HAMP terá um efeito negligenciável em condições normais de homeosta-sia do ferro, sendo a sua contribuição apenas relevante em condi-ções fisiopatológicas do metabolismo do ferro onde é necessária uma maior expressão de hepcidina. _ConclusõesOs nossos resultados, juntamente com os obtidos por outros auto-res (6,7), permitem-nos concluir que as variantes genéticas localiza-das no promotor do gene HAMP, em nc.-1010 e nc.-582, participam na regulação do metabolismo do ferro manifestando o seu efeito em indivíduos que apresentam concomitantemente outros fatores de risco (ambientais ou genéticos) para o desenvolvimento de sobre-carga em ferro. Deste modo, parece ser relevante a pesquisa destas variantes em HAMP no subgrupo de indivíduos que apresentam a variante H63D no gene HFE e um fenótipo de sobrecarga em ferro, nomeadamente com níveis de sFt ≥300 µg/L, de maneira a poder ser compreendida essa manifestação.  AgradecimentosOs autores agradecem à Unidade de Tecnologia e Inovação do Departa-mento de Genética Humana do INSA, pelo apoio técnico. Este estudo foi parcialmente financiado pela FCT: PEst-OE/SAU/UI0009/2011.                         ()Adaptado do artigo publicado em Ann Hematol. 2014 jul 13. doi: 10.1007/s00277-014-2160-7 [Epub ahead of print]LINKLINKLINKLINKLINKLINKDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim EpidemiológicoInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPwww.insa.pt201410número2ª série

http://repositorio.insa.pt/bitstream/10400.18/2375/1/Boletim_Epidemiologico_Observacoes_N10_2014_artigo2.pdf

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