Almeida, Catarina

Avó, Ana Patrícia

Doce, Ivone Água

Martins, Helena Cortes

Pádua, Elizabeth

Scientific Repository of the National Health Institute Doutor Ricardo Jorge

Subtipagem do vírus da Hepatite C por sequenciação: um contributo para o conhecimento da diversidade genética

Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

26_IntroduçãoA hepatite C é reconhecida como uma doença de importância global em Saúde Pública atingindo tanto países desenvolvidos como países em vias de desenvolvimento. O seu agente etiológico – o vírus da hepatite C (VHC) - é endémico em todo o mundo e a taxa de pre-valência da infeção pode variar significativamente, sendo influencia-da, quer pelas principais vias de transmissão, quer pelas políticas de saúde implementadas nos diferentes países (1, 2). A Organiza-ção Mundial da Saúde (OMS) estima que entre 150 a 170 milhões de indivíduos estejam infetados pelo VHC (3). Embora a incidência da infeção tenha diminuído nos últimos anos, a sua prevalência per-manece elevada devido à cronicidade da doença em cerca de 80% dos indivíduos infetados (2, 4). Em Portugal, existem poucos estudos sobre a infeção pelo VHC, estimando-se uma prevalência entre 1% e 1,5% estando esta infe-ção associada a 45% dos casos de hepatite notificados no nosso país (5, 6). No entanto, é reconhecido que nem todos os casos são notificados e muitos dos casos não são diagnosticados. Entre os países europeus, Portugal apresenta a taxa de prevalência mais elevada por VHC em grupos populacionais Utilizadores de Drogas Injetáveis (UDI), podendo esta variar entre 60% e 80% (6, 7). O VHC é caracterizado por uma elevada variabilidade genética, tra-duzida na sua classificação em 6 diferentes genótipos e em mais de 100 subtipos virais com distintos padrões de distribuição epide-miológica em todo o mundo. A taxa de evolução é rápida e o grau de diversificação dos vírus aumenta significativamente ao longo do tempo, resultando no desenvolvimento de quasispecies que são im-portantes na história natural da infeção e permitem a evasão ao sis-tema imunitário do hospedeiro (8). Apesar de não se ter conseguido ainda desenvolver uma vacina contra o VHC, têm sido alcançados avanços significativos na pro-dução de fármacos de ação direta contra o vírus (9). Contudo, devido ao elevado custo destes antivirais, a terapia combinada de INF-α-PEG e RBV mantém-se como tratamento padrão da maio-ria dos doentes crónicos (10). Este regime terapêutico induz uma Resposta Virológica Sustentada (RVS) que varia entre 42% e 82% e é dependente do genótipo do vírus em causa (10). Nas infeções pelo genótipo 1 são observadas as taxas de RVS mais baixas (40-50%). Em contraste, para os genótipos 2 ou 3 são obtidas as taxas de RVS mais elevadas, podendo atingir 80%. Taxas de RVS de va-lores intermédios (43-70%) foram associadas a infeções pelo ge-nótipo 4 (10-12).Uma vez que os vários genótipos de VHC estão associados a uma diferente evolução da infeção e doença, a genotipagem do vírus tornou-se na principal ferramenta que o clínico dispõe para a de-terminação da dosagem e duração do tratamento, bem como para o conhecimento do prognóstico da infeção. Porém, a resposta cli-nica diferenciada de doentes infetados com diferentes subtipos do mesmo genótipo de VHC, já descrita na literatura para os subtipos 1a e 1b, continua a colocar hipóteses de investigação sobre a im-portância do subtipo do vírus na resposta ao tratamento e na pro-gressão da doença crónica pelo VHC (13).O método de sondas em linha, baseado na hibridação rever-sa (designado por LiPA), é o ensaio comercial mais utilizado nos países europeus para a genotipagem do VHC. No entanto, apre-senta um fraco desempenho para a subtipagem dos vírus (14). Em 2009, o Laboratório Nacional de Referência de Infeções Se-xualmente Transmissíveis-VIH e vírus da Hepatite B e C do INSA desenvolveu um ensaio molecular in house para melhorar a clas-sif icação do VHC (14). Nos últimos 3 anos, este ensaio tem sido correntemente utilizado no laboratório e aplicado em amostras clínicas em que não foi possível determinar o subtipo de VHC quando previamente submetidas ao ensaio comercial LiPA._Subtipagem do vírus da Hepatite C por sequenciação: um contributo para o conhecimento da diversidade genética   Elizabeth Pádua, Ana Patrícia Avó, Ivone Água Doce,  Catarina Almeida, Helena Cortes Martins elizabeth.padua@insa.min-saude.ptLaboratór io Nacional de Referência de Infeções Sexualmente Transmissíve is. Depar tamento de Doenças Infeciosas, INSA.artigos breves_   n. 8 _Doenças InfeciosasDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim EpidemiológicoInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP201409número2ª sérieInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPwww.insa.ptartigos breves_   n. 827_ObjetivosO presente estudo pretende dar a conhecer os resultados da ca-racterização molecular do VHC, realizada no Laboratório Nacio-nal de Referência de Infeções Sexualmente Transmissíveis  - VIH e vírus da hepatite B e C do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ri-cardo Jorge (INSA) entre 2008 e 2013, e revelar o contributo de um ensaio in house para a determinação dos subtipos por análise de sequências virais do VHC._Material e métodosFoi realizada uma análise retrospetiva dos resultados da genotipa-gem do VHC obtidos no Laboratório Nacional de Referência de In-feções Sexualmente Transmissíveis - VIH e vírus da hepatite B e C entre 2008 a 2013. A caracterização molecular para a classificação do vírus foi realizada pelo ensaio comercial (VERSANTTM HCV Geno-type 2.0 Assay-LiPA (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarryto-wn, NY, USA). As amostras em que o subtipo não foi determinado foram submetidas a um ensaio molecular in house, baseado na am-plificação, sequenciação e análise de duas regiões genómicas do VHC - as regiões C/E1 e NS5B (14)._Resultados e discussão Caracterização da população estudadaDurante o período em análise foi realizada a genotipagem do VHC pelo ensaio comercial LiPA em 1004 amostras clínicas de indivídu-os infetados por VHC, das quais 71,1% foram obtidas de reclusos, 13,4% de indivíduos da população em geral sem risco conhecido e 4,4% de UDI. Em relação ao género, 90,5% eram provenientes de homens e 9,5% de mulheres, sendo que a idade média da popula-ção analisada variou anualmente entre 35,3 e 42,4 anos (Tabela 1). Genotipagem do VHCOs resultados de genotipagem ao longo do período em análise re-velaram uma maior frequência de infeções pelo genótipo 1 (55%, variando entre 50,7% e 57,9%), seguida do genótipo 3 (28,2%, va-riando entre 21,0% e 35,5%) e do genótipo 4 (13,9%, variando entre 11,0% e 15,9%). O genótipo 2 foi o menos frequente (1,5%, varian-do entre 0% e 2,3%) e não foram detetados casos de infeção pelos genótipos 5 e 6. Verificou-se, ainda, que 1,4% (n=14) das amostras analisadas apresentaram um resultado inconclusivo pelo método LiPA, incluindo três casos que revelaram um perfil compatível com infeção mista por diferentes genótipos de VHC (Tabela 2). O genótipo 1, seguido do genótipo 2 e do genótipo 3 têm sido descri-tos como os mais prevalentes a nível mundial, nomeadamente nos con-tinentes Europeu e Americano. Neste estudo, os genótipos 1 e 3 foram os mais frequentes ao longo dos 6 anos em análise (Tabela 2). Por outro lado, foi observado que 13,9% das infeções correspondiam ao genótipo 4, que tem sido descrito na literatura como mais prevalente em países do Médio Oriente e no do norte de África, em particular no Egipto (15, 16).Subtipagem do VHCNo presente estudo, observou-se que, do total dos casos classifica-dos de genótipo 1, cerca de 78,3% (432/552) pertenciam ao subti-po 1a e 18,1% (100/552) ao subtipo 1b. Em 3,6% (20/552) dos casos não foi possível determinar o subtipo do vírus pelo ensaio comercial LiPA. Observou-se ainda, que a diferença proporcional entre a fre-quência do subtipo 1a e a do subtipo 1b foi constante em cada ano, e ao longo do período em análise, sendo sempre mais frequente para o subtipo 1a. Contudo, na literatura é descrito que o subtipo 1b é o subtipo mais prevalente a nível mundial, amplamente distribuído na Europa e em alguns países de África e do Sudoeste Asiático, encon-trando-se associado a indivíduos de idade avançada e que adquiri-ram a infeção por transfusões sanguíneas no passado (16, 17). Neste estudo, a maioria dos casos identificados como subtipo 1b eram re-clusos e de uma faixa etária mais jovem. O segundo subtipo mais frequente na população estudada foi o subti-po 3a (28,2%), que à semelhança do que acontece para o subtipo 1a, foi descrito como comum em UDI em vários países Europeus (15-18). Neste trabalho e apesar do viés de seleção da população estudada, não pode ser excluído o eventual uso de drogas endovenosas pelos indivíduos que constituem o grupo de reclusos. Das 1004 amostras clinicas submetidas ao ensaio comercial LiPA, não foi possível subtipar o VHC em 185 (18,4%) casos: em 126 (64,3%) o subtipo não foi descriminado e em 59 (30,1%) o subtipo não foi deter-minado. Em 11 casos a subtipagem foi inconclusiva. Assim, e no sen-tido de melhorar os resultados da classificação do VHC para estes casos, procedeu-se à sequenciação das regiões genómicas virais C/E1 e NS5B, utilizando um ensaio molecular in-house, desenvolvi-do no Laboratório Nacional de Referência IST-VIH e Hepatite B e C do INSA. Este novo método foi aplicado em 87 (44,4%) das amostras sem subtipo conhecido, nas restantes o volume disponível mostrou-se in-suficiente. A sequenciação e análise das regiões genómicas amplifica-das permitiram determinar com êxito o subtipo do VHC em 86 (98,9%) destas amostras. (Tabela 3).Doutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim EpidemiológicoInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP201409número2ª sérieInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPwww.insa.ptartigos breves_   n. 828Doutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim EpidemiológicoInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP201409número2ª sérieInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPwww.insa.ptTabela 2:      Resultados de genotipagem do VHC (ensaio LiPA 2.2), 2008-2013.Ano201320122011201020092008TotalGenotipo 1% (n)50,7% (71)51,4% (71)57,7% (41)57,9% (124)52,3% (134)51,6% (111)55% (552)Genotipo 2% (n)0,71% (1)002,3% (5) 1,8% (4)2,3% (5)1,5% (15)1 Genotipo 3% (n)33,6% (47)35,5% (49)21,1% (15)21,0% (45)27,4% (62)30,7% (66)28,2% (283)2 Genotipo 4 % (n)14,3% (20)12,3% (17)15,5% (11)15,9% (34)11% (25)14,9% (32)13,9% (140)Inconclusivo% (n)0,7% (1)0,7% (1)5,6% (4)2,8% (6)0,4% (1)0,5% (1)1,4% (14)1  Todos os casos foram classificados de subtipo 3a   2  Identificados casos não subtipados de genótipo 4 e casos de subtipo indiscriminado 4a/4c/4dTabela 1:      Caracterização da população estudada para genotipagem do VHC, 2008-2013.Grupo populacionalANO201320122011201020092008TOTALTotal(n)140138712142262151004Homens % (n)85,7% (120)92,8% (128)83,1% (59)92,5% (198)93,4% (211)89,8% (193)90,5% (909)Mulheres% (n)14,3% (20)7,2% (10)16,9% (12)7,5% (16)6,6% (15)10,2% (22)9,5% (95)Idade média (n)41,2 (106)39,6 (116)42,4 (57)35,3 (71)36,5 (110)39,6 (146) 38,6 (606)Pop. em geral% (n)23,6% (33)16,7% (23)25,4% (18)16,4% (35)10,6% (24)0,9% (2)13,4% (135)1 Reclusos76,4% (107)77,5% (107)38% (27)79,4% (170)88,9% (201)49,8% (105)71,1% (714)UDI% (n)05,8% (8)36,6% (26)4,2% (9)0,4% (1)04,4% (44)1  Não podem ser excluídos comportamentos de risco para a infeção VHC, nomeadamente o uso de drogas injetáveis (UDI)ANO Total(n)Não subtipadas e/ou inconclusivas (n) Total(n)Subtipadas(n)Não subtipadas(n)2013 140 23 23 23 02012 138 20 19 19 02011 71 16 14 14 02010 214 47 4 4 02009 226 43 6 5 12008 215 47 21 21 0Total 1004 196 87 86 1Amostras analisadas por LiPAAmostras analisadas pelo ensaio molecularin house (sequenciação da região CE1e/ou NS5B do VHC) 1Tabela 3:      Resultados da subtipagem do VHC pelo ensaio molecular in house em amostras clínicas não subtipadas e /ou inconclusivas no ensaio comercial LiPA 2.2.1  Todas as amostras com volume suficiente para o ensaio molecular in house 2ª sérieartigos breves_   n. 829_ConclusãoO elevado desempenho revelado pelo ensaio molecular in house na determinação dos subtipos virais, comparativamente ao ensaio comercial LIPA, possibilita uma melhoria na classificação do VHC e, deste modo, contribui para aumentar o conhecimento do papel da diversidade genética na progressão da doença.Num futuro próximo, e de forma mais alargada, os antivirais apro-vados para tratamento da infeção pelo VHC serão administrados a doentes crónicos, facto que tem implicações clínicas e virológicas a curto prazo (19). É por isso crucial implementar a melhor estra-tégia laboratorial para a classificação dos vírus e estar prepara-do para a nova era de tratamento e monitorização da infeção pelo VHC. Neste sentido, o Laboratório Nacional de Referência de In-feções Sexualmente Transmissíveis - VIH e vírus da hepatite B e C do INSA está já a desenvolver métodos laboratoriais que permitam a análise molecular de outras regiões genómicas do VHC alvo dos antivirais, nomeadamente dos inibidores da protease NS3/4A, bem como a pesquisa de mutações de resistência aos antivirais utiliza-dos no tratamento da hepatite C.LINKLINKLINKLINKLINKLINKLINKLINKDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim EpidemiológicoInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP201409número2ª sérieInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPwww.insa.pt(15) de Bruijne J, Schinkel J, Prins M, et al. 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