Coelho, Andreia

Dias, Alexandra

Faustino, Paula

Ferreira, Emanuel

Lavinha, João

Morais, Anabela

Nunes, Baltazar

Picanço, Isabel

Scientific Repository of the National Health Institute Doutor Ricardo Jorge

Variação genética associada ao nível de hemólise crónica na drepanocitose: um estudo longitudinal

Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

201408número2ª série_Variação genética associada ao nível de hemólise crónica na drepanocitose: um estudo longitudinal13_IntroduçãoA compreensão da causa e mecanismo das doenças complexas (multifatoriais) frequentes pode beneficiar largamente do estudo de doenças mendelianas (monogénicas) raras devido à sua relati-vamente mais simples etiopatogénese. A drepanocitose é uma anemia crónica monogénica, autossómica recessiva, clinicamente heterogénea, caraterizada por episódios graves e recorrentes de vaso-oclusão e infeção e por hemólise crónica. A apresentação, o curso e o desfecho da doença dependem de determinantes am-bientais, comportamentais e genéticos. A hemólise intra- e extra-vascular está na origem de algumas das complicações da doença, especialmente devido à consequente alteração na biodisponibilida-de do óxido nítrico (NO). Entre os chamados sub-fenótipos hemolí-ticos da drepanocitose incluem-se o AVC, a hipertensão pulmonar, o priapismo, as úlceras de perna e a colelitíase (1). _ObjetivosPara identificar preditores precoces de vaso-oclusão na drepa-nocitose, estudámos a associação entre três biomarcadores de hemólise e a herança de variantes genéticas em genes candida-tos relacionados com o nível de hemoglobina fetal (HbF), a adesão vascular dos eritrócitos, o tónus vascular e, ainda, um determinan-te alfa-talassémico numa série de doentes pediátricos seguidos longitudinalmente. _Material e métodosParticipantes: 99 doentes pediátricos com drepanocitose ho-mozigótica (SS) seguidos em dois grandes hospitais gerais da área metropolitana de Lisboa, 97% dos quais de origem sub-sariana. Idade à entrada no estudo (mediana): 9,9 anos. Tempo de seguimento/doente (mediana): 5,0 anos. Foi obtido consentimen-to informado dos representantes legais dos participantes.Caraterização fenotípica: Os dados clínicos, hematológicos e bio-químicos, incluindo os relevantes para este estudo (Hb, LDH, bilir-rubina total, reticulócitos), foram colhidos retrospetivamente nos processos clínicos dos doentes. Genotipagem: Realizada em DNA genómico total isolado de leucó-citos do sangue periférico por varias técnicas baseadas na PCR. Foram caraterizadas 41 variantes genéticas (34 SNP, 6 indel, 1 STR), com frequência do alelo minor ≥ 0,05 na população de doen-tes, nos loci seguintes: BCL11A, CD36, EDN1, HBA, agrupamento HBB (incluindo HBG2 ), ITGA4, HMOX1, NOS3, THBS1 e VCAM1. Todas as distribuições genotípicas se encontravam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. A partir dos genótipos obtidos foram inferidos 105 haplotipos (PHASE). No entanto, apenas os 51 com frequência > 0,02 foram considerados na análise estatística. Colheita e análise de dados: Foi construída uma base de dados demográficos e clínicos. Os estudos de associação entre genóti-pos nos loci candidatos e biomarcadores de hemólise foram rea-lizados através de testes paramétricos (LDH, bilirrubina total) ou não-paramétricos (reticulócitos) com subsequente correção para comparações múltiplas (2). Foram assumidos diferentes modelos de hereditariedade. _ResultadosForam colhidos dados demográficos e clínicos relativos a 557 pessoa*ano, incluindo 738 crises (530 vaso-oclusivas, 466 infecio-sas, 143 anémicas). No entanto, neste estudo apenas as observa-ções inter-crise foram consideradas por serem as que mais bem representam uma complicação crónica da doença como é a he-mólise. Os resultados obtidos revelaram uma associação entre os marcadores de hemólise e (i) variantes em dois genes relacionados com a adesão dos drepanócitos ao endotélio vascular (VCAM1, CD36), (ii) uma variante do NOS3, o produto do qual gera NO nas células endoteliais implicadas no tónus vascular e (iii) um determi-nante alfa-talassémico, um notório modificador da gravidade da drepanocitose (Quadro 1 e Gráfico 1).  (1) Departamento de Genética Humana, INSA. (2) Departamento de Pediatria, Hospital Prof Doutor Fernando Fonseca. (3) Departamento de Pediatria, Hospital de Santa Maria.(4) Departamento de Epidemiologia, INSA.Andreia Coelho1, Alexandra Dias 2, Anabela Morais 3,  Baltazar Nunes4, Emanuel Ferreira1, Isabel Picanço1,  Paula Faustino1, João Lavinha1  joao.lavinha@insa.min-saude.ptInstituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.ptartigos breves_  n. 5 _Doenças Genéticas201408número2ª série14Doutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.ptartigos breves_ n. 5a  A primeira posição representa o alelo ancestral       b  Os níveis individuais dos pacientes são médias dos valores inter-crise medidos ao longo do período de seguimento       c  Hapl X = Não-hapl 9Gene Referênciada variante AleloaAlelo ou haplótipoassociado Presença do alelo ou haplótipoassociadoNúmero de pacientesLDH (U/L)média±DP pBilirrubin total (mg/dL)média±DPpContagem de reticulócitos (%)média±DPprs3783613 G/C Crs3176878 C/T Crs3783615 A/T AVCAM1-geners3176879 A/G AHapl 7simnão12491270,6±279,3926,6±348,4p=0,002rs1409419 C/T Crs3917024 C/T Trs3917025 TC/delTC delTCrs3783597 C/G Grs3783598 T/G Trs1041163 T/C CVCAM1-promotorrs3783599 C/T THapl 9Heterozigotia(Hapl 9/Hapl X) cHomozigotia(Hapl 9/Hapl 9;Hapl X/Hapl X)4881,65±0,052,50±0,43p<0,001sim 45 13,06±0,809,26±0,56CD36 rs1984112 A/G Gnão 50p=0,001sim 90 2,41±0,425,18±0,01NOS3 rs2070744 C /T Tnão 2p<0,001sim 41 2,04±0,402,80±0,40não 52p=0,002sim 42 8,77±0,4813,21±0,73HBA n/aNão- del/del3,7kbdel 3,7kbnão 53p<0,001Marcadores de hemólise bQuadro 1:      Associação entre variantes de genes candidatos e marcadores de hemólise na drepanocitose.Gráfico 1:      Número de pacientes com drepanocitose com (+) ou sem (-) uma variante genética em (A) VCAM1, (B) HBA e NOS3, or (C) CD36 e HBA com os níveis de, respetivamente, a LDH sérica, bilirrubina total e contagem de reticulócitos nos dois quartis extremos (Q1, Q4).Q1 Q4VCAM1_gene_Hapl7A. LDH sérica B. Bilirrubina total C. Contagem de reticulócitosAlelo + Alelo - Q1 Q4 Q1 Q4HBA-alf a3.7 HBA-alf a3.7NOS3_Hapl40510152025Q1 Q4 Q1 Q4CD36_G024681012141618051015202530Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP201408número2ª série15Doutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.ptartigos breves_   n. 5_DiscussãoA hemólise crónica é um traço distintivo do curso clínico da drepa-nocitose. Neste estudo demonstrámos uma associação estatistica-mente significativa entre parâmetros bioquímicos ou eritrocitários correlacionados com diferentes estadios do fenótipo hemolítico e determinantes genéticos da adesão celular, metabolismo do NO e alfa-talassémia. Moléculas de adesão (VCAM1, CD36): A adesão dos drepanócitos ao endotélio vascular é um fator crítico na patogénese da drepanoci-tose. Considerando um marcador proximal de hemólise (LDH sérica), foi testada a hipótese de que as variantes observadas no locus VCAM1 (tanto no promotor como no gene) possam ser modificadoras do fe-nótipo drepanocítico. Foram já identificadas variantes hiperativas do promotor (predisponentes para vaso-oclusão) e, na variante intra-gé-nica G1238C, o alelo C foi associado a proteção contra AVC. Neste estudo, o VCAM1_gene_haplótipo 7 (que inclui o referido alelo C) foi associado a níveis mais elevados de LDH e, potencialmente, a um fenótipo hemolítico mais grave. Estas observações aparentemente contraditórias poderão resultar de um papel dual da variante G1238C na etiologia molecular do AVC e da hemólise e/ou a modulação do fenótipo pelas outras três variantes que definem o haplótipo. Consi-derando um outro marcador de hemólise (bilirrubina total), foram ob-servados níveis mais baixos em associação com a heterozigotia para o VCAM1_promotor_haplótipo 9. Este achado constituirá mais um exemplo do efeito protetor proporcionado pelo estado de heterozigo-tia para uma variante genética (vantagem do heterozigoto) (3, 4).Verifica-se que os reticulócitos e eritrócitos nos doentes drepanocí-ticos têm uma expressão de CD36 superior aos indivíduos controlo. Por outro lado, sabe-se que a ligação da CD36 à trombospondina-1 promove a adesividade vascular. Neste estudo, o alelo rs1984112_G (localizado na 5’UTR do gene CD36) mostrou estar associado a uma elevação da contagem de reticulócitos, uma consequência distal da hemólise. Assim, a herança deste alelo parece ser um fator de risco na drepanocitose, particularmente em relação à hemólise subse-quente a um reforço da adesão celular (5).Metabolismo do NO: Observaram-se baixos níveis de bilirrubina total em associação com o alelo rs2070744_T no promotor do gene NOS3, o qual codifica a NO-sintase 3 que catalisa a produção de NO nas cé-lulas endoteliais. O NO é um gás com potentes propriedades vasodila-tadoras e anti-adesivas necessárias à manutenção do lúmen vascular. Na drepanocitose observa-se um estado de resistência ao NO media-do pela inativação do NO pela Hb plasmática libertada na hemólise. A referida variante do promotor do NOS3 parece ter um efeito sobre a ex-pressão dos respetivos mRNA e proteína. O alelo C já foi considerado um fator de risco para doença coronária, enquanto o alelo T parece ter um efeito protetor na componente hemolítica da drepanocitose (6). Alfa-talassémia: A presença da deleção de 3,7kb no gene HBA foi encontrada em associação com níveis mais baixos de hemólise (evidenciados pela bilirrubina total e contagem de reticulócitos). A alfa-talassémia, em co-herança com a drepanocitose, foi um dos primeiros modificadores genéticos desta a ser identificados em particular no que respeita ao sub-fenótipo hemolítico. Os doen-tes que apresentam a deleção de, pelo menos, um gene HBA têm uma hemólise reduzida em resultado de uma mais baixa concen-tração intracelular de HbS, a qual, por seu turno, diminui os danos celulares (falciformação) associados à polimerização da HbS (7). _ConclusõesNo seu conjunto, os nossos achados sugerem uma arquitetura ge-nética complexa para o processo hemolítico na drepanocitose, en-volvendo várias vias metabólicas, nomeadamente adesão às células do endotélio vascular, síntese do NO e controlo do volume e he-moglobinisação dos eritrócitos (8). No entanto, devido à baixa pre-valência das variantes genéticas significativamente associadas ao sub-fenótipo hemolítico, os nossos resultados carecem de replica-ção numa coorte mais numerosa seguida durante um período mais longo. Neste estudo propusemos várias hipóteses mecanísticas compatíveis com as observadas associações genótipo/fenótipo. São, por isso, necessários estudos funcionais que explorem as perspetivas agora abertas para uma melhor compreensão da va-riabilidade clínica inter- e intra-individual da drepanocitose (e outras doenças cardio-vasculares comuns) com potencial impacto positivo na personalização das intervenções terapêuticas. AgradecimentosAos pacientes e suas famílias. À Unidade de Tecnologia e Inovação do INSA pelo apoio técnico. À FCT pelo apoio financeiro (PIC/IC/83084/2007 e CIGMH). Adaptado do artigo publicado em: European Journal of Haematology. 2014;92(3): 237-43. doi: 10.1111/ejh.12226Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IP201408número2ª série16Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.ptartigos breves_   n. 5Referências bibliográficas:(1) Steinberg MH, Sebastiani P. Genetic modif iers of sickle cel l disease.  Am  J Hematol. 2012;87(8):795-803.(2) Bouaziz M, Jeanmougin M, Guedj M. Multiple testing in large-scale genetic studies.  Methods Mol Biol. 2012; 888:213-33.(3) Dworkis DA, Klings ES, Solovief f N, et al. Severe sickle cel l anemia is associated with increased plasma levels of TNF-R1 and VCAM-1. Am J Hematol. 2011;86(2):220-3. (4) Dean M, Carrington M, O'Brien SJ. Balanced polymorphism selected by genetic versus infectious human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2002; 3:263-92.(5) Zhang Y, Hildesheim ME, Nouraie M, et al. Plasma thrombospondin-1 is increased during acute sickle cell vaso-occlusive events and associated with acute chest syndrome, hydroxyurea therapy, and lower hemolytic rates. Am J Hematol. 2012;87(3):326-30.(6) Cattaruzza M, Guzik TJ, Słodowski W, et al. Shear stress insensitivity of endothelial nitric oxide synthase expression as a genetic risk factor for coronary heart disease. Circ Res. 2004; 95(8):841-7.(7) Steinberg MH, Embury SH. Alpha-thalassemia in blacks: Genetic and clinical aspects and interactions with the sickle hemoglobin gene. Blood. 1986; 68(5):985-90. (8) Milton JN, Rooks H, Drasar E, et al.; Walk-PHAAST Investigators, Steinberg MH. Genetic determinants of haemolysis in sickle cell anaemia. Br J Haematol. 2013;161(12):270-8.LINKLINKLINKLINK

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