Miguéns, Diana

Salvador, Daniel

Valério, Elisabete

Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

06_IntroduçãoAs cianobactérias são organismos ubíquos, existindo principalmen-te em ambiente aquáticos, onde geralmente coocorrem com outros microrganismos, como bactérias heterotróficas (1). Em condições fa-voráveis de luz e nutrientes, as cianobactérias podem crescer rapi-damente e atingir populações com elevadas densidades celulares designadas por florescências ou blooms (2). Estes fenómenos estão frequentemente associados à produção de toxinas causando assim problemas ecológicos, económicos e de saúde pública. As micro-cistinas (MC) são o tipo de hepatotoxinas mais abundantemente pro-duzido pelas cianobactérias. Existem cerca de 80 variantes destas toxinas, sendo a microcistina–LR, –RR e –YR as mais comuns. Alguns estudos mostraram que muitas espécies de cianobacté-rias formadoras de blooms preferem crescer na presença de ou-tras bactérias (3). Além disso, Giaramida et al. (1) relataram que a exposição à microcistina tem contribuído significativamente para a definição da estrutura das comunidades bacterianas e fisiologia microbiana dos corpos de água estudados. Isso atribui um papel de relevo às cianobactérias tóxicas no controlo da diversidade fi-toplanctónica e abundância das espécies microbianas. Por ou-tro lado, existem bactérias capazes de degradar as cianotoxinas, como por exemplo a microcistina (1, 3), tendo já sido levantada a hipótese de que a presença de bactérias heterotróficas na água pode desempenhar um papel importante na limpeza natural des-sas hepatotoxinas quimicamente estáveis (3). Apesar destas evi-dências, o verdadeiro papel de cianobactérias e suas interações com bactérias heterotróficas ainda é pouco conhecido._ObjetivosPor forma a colmatar o desconhecimento que existe relativamen-te ao impacto das microcistinas em bactérias heterotróficas de água doce, pretendeu-se neste trabalho isolar algumas bactérias de água doce, algumas coexistindo com cianobactérias tóxicas. Após a confirmação da identif icação de isolados, estas bactérias foram expostas a três concentrações diferentes de cada uma de três variantes (MC-LR, -RR, -YR) e o efeito sobre as suas curvas de crescimento foi avaliado. _Materiais e métodosAmostragem As amostragens decorreram primeiramente na Albufeira de Ma-gos, Açude de Monte da Barca e Albufeira de Patudos, onde se observam frequentemente blooms de cianobactérias. A segunda amostragem foi feita na Albufeira de Castelo de Bode, um reser-vatório onde geralmente não ocorrem blooms de cianobactérias. As amostras foram recolhidas em frascos esteril izados de 1 L e transportadas numa mala térmica refrigerada, no escuro.Isolamento de bactérias As bactérias foram isoladas através do espalhamento de 100 µL das amostras de água de cada reservatório, usando esferas de vi-dro esterilizadas, em meio não seletivo Reasoner'2A (R2A). Todas as placas inoculadas foram incubadas a 20 ± 2ºC no escuro, para impedir o crescimento de cianobactérias, durante quatro dias. Após este período, selecionaram-se duas a três colónias individualizadas diferentes que foram purificadas em meio Nutriente Agar (NA).Caracterização e identificação dos isoladosA forma bacteriana foi avaliada microscopicamente, e os isolados classificados de acordo com o seu grupo Gram. Para identificar molecularmente os isolados, amplificou-se o gene do rRNA 16S, por PCR usando primers universais: 104F e 907R (4) ou o par 8F e 1492R (5). Os produtos de PCR foram purificados e enviados para sequenciar, em ambas as direções, na unidade UTI-INSA.Crescimento bacterianoAs bactérias isoladas foram expostas a três concentrações diferen-tes de cada variante da MC (MCLR e MCRR:1 nM, 10 nM e 1000 nM; MCYR: 1 nM, 10 nM e 300 nM), e os efeitos nas curvas de cres-cimento bacteriano foram avaliados em microplacas de 96 poços. As concentrações escolhidas situam-se em valores próximos dos normalmente encontrados em ambientes naturais.  _Impacto das microcistinas no crescimento de bactérias aquáticas  Diana Miguéns, Daniel Salvador, Elisabete Valérioelisabete.valerio@insa.min-saude.ptUnidade de Água e Solo. Departamento de Saúde Ambiental, INSA.artigos breves_   n. 2 _Fatores de Risco em Ambientes Hídricos especial 420142ª sérienúmero:Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt07artigos breves_   n. 2_Resultados e discussãoTem-se pesquisado intensamente qual o impacto das microcistinas em animais e plantas, no entanto o seu impacto em bactérias, que coabitam com cianobactérias de água doce encontra-se ainda por esclarecer.Neste trabalho avaliou-se o impacto de três variantes da MC (-LR, -RR, -YR) no crescimento de bactérias heterotróficas isoladas em três albufeiras portuguesas, onde frequentemente se observam blooms de cianobactérias, algumas produtoras de MC, assim como em bactérias isoladas de uma albufeira onde estes fenóme-nos geralmente não acontecem. Primeiramente procedeu-se à caracterização morfológica das bac-térias isoladas e à determinação do seu tipo de coloração Gram (figura 1).Os isolados foram de seguida identif icados pelo seu posicio-namento filogenético construído com base no gene rRNA 16S. Os isolados distribuíram-se por três f ilos: Firmicutes (Bacil lus sp.), β- proteobacteria (Vogesel la indigofera ), e γ- proteobacte-ria (Raoultel la terr igena, Aeromonas hydrophila, e Shewanella putrefaciens). A diversidade e o tipo de bactérias heterotróficas isoladas neste estudo está de acordo com o que já foi descrito anteriormente, em habitats onde estas bactérias coabitam com cianobactérias (3,6,7).De seguida, os isolados foram expostos a três concentrações diferentes de cada variante da MC, e os efeitos nas curvas de crescimento bacteriano foram avaliados (tabela 1). Verif icou-se que as MC podem reduzir o crescimento da maioria das seis bactérias testadas (B6, P1 e P6), sendo que algumas bactérias cresceram sem efeito algum induzido (C4), enquanto outras rea-giram de forma diferente consoante a variante e a concentração usada no mesmo isolado (M1 e M5). Em relação às curvas de crescimento dos seis isolados testa-dos, estas só apresentaram diferenças significativas entre as cé-lulas expostas às microcistinas e as células controlo no final da fase exponencial/início da fase estacionária. Contudo, observou-Figura 1:      Imagens representativas dos isolados testados.(A) Aeromonas hydrophyla B6;  (B) Baci l lus sp. M1;  (C) Shewanel la putrefac iens P6;   (D) Vogese l la ind igofera C4 (são visíveis os grãos de indigotina).especial 420142ª sérienúmero:Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt08artigos breves_   n. 2-se maioritariamente uma diminuição do crescimento bacteriano. Não foi observada uma inibição como descrito por Yang et al. (8) quando expuseram Escherichia coli a 1000 e 5000 nM de MCRR. Porém, as concentrações de toxinas usadas neste estudo, foram mais próximas das concentrações inferiores testadas por Yang et al. (8), em que não observaram um efeito marcado da exposi-ção da E.coli a MCRR. A inibição do crescimento bacteriano pelas MCs está de acordo com o que Giaramida et al. (1) sugeriram, em que as cianobactérias produtoras de microcistinas aparentam ter um papel no controlo da população de bactérias heterotróficas nos corpos de água doce. O isolado de Vogesella indigofera, isolado a partir da albufeira onde geralmente não se observam blooms, não sofreu qualquer tipo de efeito na presença de cada uma das três variantes de MC (tabela 1). Perante este comportamento coloca-se a hipótese de que este iso-lado possa ser capaz de degradar as MC e por isso não manifestar nenhum efeito no seu crescimento na presença das mesmas._ConclusõesEste estudo mostrou que as microcistinas-LR, -RR e YR podem induzir uma redução no crescimento dum grupo diversif icado de bactérias heterotróficas, não patogénicas, isoladas a partir de al-bufeiras. Este impacto induzido pelas microcistinas pode levar ao desequilíbrio da comunidade microbiana existente nos corpos de água doce, o que pode ter implicações ambientais e na qualida-de da água para uso recreativo.Referências bibliográficas:(1) Giaramida L, Managed PM, Edwards C, et al. Bacterial communities response to microcystins exposure and nutr ient avai labi l i ty: Linking degradation capacity to community structure. Int. Biodeterior. Biodegrad. 2013; 84:111-17.(2) Codd GA, Morr ison LF, Metcalf JS. Cyanobacterial toxins: r isk management for health protection. Toxicol Appl Pharmacol. 2005;203(3):264-72. Review.(3) Berg KA, Lyra C, Sivonen K, et al. High diversity of cultivable heterotrophic bacteria in asso-ciation with cyanobacterial water blooms. ISME J. 2009;3(3):314-25.Epub 2008 Nov 20.(4) Chaves S. Diversidade de procariotas sulfato-redutores e desnitr if icantes em amostras ambientais. [Sl, s.n.], 2005. Tese de doutoramento-Universidade de Lisboa.(5) Turner S, Pryer KM, Miao VP, et al. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. J Eukaryot Microbiol. 1999;46(4):327-38.(6) Parveen B, Ravet V, Djediat C, et al. 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Bull. 2010;55(18)1894-98.Tabela 1:      Alterações observadas na fase final da curva de crescimento bacteriano, na presença de microcistinas, relativamente ao controlo. 1 nM MCLR10 nM MCLR1000 nM MCLR1 nM MCRR10 nM MCRR1000 nM MCRR1 nM MCYR10 nM MCYR300 nM MCYR-3,4*-5,3*-2,0*-2,0-1,4-5,1-3,4*-4,1*-3,1*-6,8-8,7-3,1-11,1*-12,5*-6,8*-8,8-11,31,6-4,9*-4,4*-5,1*-5,5*-5,8*-4,3*-5,2*-7,5*-3,7*-6,3*-7,4*-6,8*-6,5*-4,9*-4,7*-6,2*-8,2*1,1-9,5*-7,4*-6,5*-6,1*-7,1*-6,7*-8,1*-8,3*-6,2*Aeromonas hydrophyla B6Aeromonas hydrophyla M5Raoultella terrigenaP1Shewanella putrefaciensP6Vogesella indigoferaC4Bacillus sp. M1% % % % % %* Signif icativamente diferente do controlo (P < 0,05).000000000especial 420142ª sérienúmero:Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt

Impacto das microcistinas no crescimento de bactérias aquáticas

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