Aleutian mink disease virus (AMDV), species Carnivore amdoparvovirus 1 and family Parvoviridae, causes Aleutian disease (AD), one of the most significant infectious diseases of American mink. It causes high antibody levels, plasmacytosis, and immune complex disease with symptoms ranging from subclinical to fatal. After the first cases were reported in North America in the 1950s, the virus spread to all mink-producing countries and to nature, where it infected several other mustelid and carnivore species. This thesis focused on AMDV epidemiology, evolution, transmission, varying disease severity, and development of polymerase chain reaction (PCR) and sequencing methods to increase understanding on the disease and provide solutions for disease control.
Currently, AMDV diagnostics in Finland is based on antibody screening with ELISA and confirmation of positive results with PCR using DNA exctacted from spleen. However, non-specific products caused frequent delays in PCR diagnostics. To update the diagnostics, we validated two used SYBR green-based PCRs (pan-AMDV-PCR and pan-AMDO-PCR) and established a novel probe-based PCR (NS1-probe-PCR). All three PCRs had comparable sensitivities (down to 20 copies/reaction) defined by plasmid dilution series and diagnostic spleen samples. The NS1-probe-PCR was chosen as the primary method due to optimal performance.
We also optimized two previously published methods for whole-genome sequencing. Insufficient sequence data for an efficient primer design proved to be an issue with the first protocol relying on PCR amplification of the genome, which is why we modified a metagenomic approach for ssDNA virus sequencing and successfully used it to sequence the entire AMDV genome from five samples.
To study the impact of intense farming practices on evolution and transmission of AMDV, we analyzed virus strains from fur farms and free-ranging mustelids from Finland and Poland. Viral sequences indicated that AMDV had appeared in both countries on several separate occasions, and country-specific clustering and frequent transmission between countries were observed. Results from comparison of strains from farmed and free-ranging mink differed between countries. Sequence data from Poland confirmed that farming affects AMDV diversity in the wild within and between study sites.
Further sequence analysis identified frequent coinfection and recombination. Two major and several possible recombination breakpoints were identified. The evolution rate of AMDV was estimated to be higher than with most DNA viruses and slightly higher than with other parvoviruses, probably due to farming conditions with many mink being in close proximity. The degree of within-host evolution was higher in free-ranging mink than farmed mink, indicating that they had lived with the virus longer than farmed mink, which are usually culled annually. No notable difference was detected between free-ranging and farmed mink in positive and negative selection patterns in partial NS1 protein. However, a more thorough comparison would require a larger dataset of the complete genomes of both groups than is currently available.
American mink and native mustelids from Poland were analyzed for AMDV antibodies with ELISA. The proportion of infected mink was higher in males than females, adults than juveniles, and in areas close to the mink farms, indicating virus flow from farms into the wild. The proportion of ELISA-positive individuals among native mustelids appeared to correlate with the expected contact of the species with the mink. Almost all the ELISA-positive mink were PCR-positive, but only a fraction of the ELISA-positive native mustelids were also PCR-positive, suggesting lower persistence of AMDV in the latter.
In addition to being found among native mustelids, AMDV DNA was also detected in stools of farmed blue foxes, indicating that they may be infected and secrete the virus in stool. However, more research is required to exclude the possibility of viruses originating from the contaminated environment or food.
In order to study varying disease severity, we compared a farm with mainly asymptomatic mink and a decades-long history of breeding a disease-tolerant herd, a farm with symptomatic mink, and an AMDV-negative farm. Differences in viral loads in spleens and kidneys were observed between asymptomatic and symptomatic mink. In the farm with AMDV-tolerant mink, a notable proportion of ELISA-negative mink were PCR-positive during the 2.5-year follow-up, indicating very low antibody production. Transcriptome analysis revealed differences in gene expression between farms. The results show that mink can live with the virus for years without visible symptoms, have a normal litter size and pelt quality, and bring up breeding of tolerant herd as an option in disease control.
In summary, we updated PCR diagnostics to improve speed and reliability that are important in disease control. Additionally, we set up a metagenomic protocol to sequence AMDV without prior sequence information. These studies also brought new information about AMDV epidemiology and host dynamics that can be used to better understand virus history, and transmission between farms and the wild, between countries, and between species. Comparison of mink with a different disease status gave information about AMDV pathogenesis in different stages of infection and gave new insights into disease control.Aleutian tauti -virus (AMDV, Aleutian mink disease virus) aiheuttaa Aleutian tautia, joka on yksi minkin yleisimmistä infektiotaudeista. Se aiheuttaa korkeita vasta-ainetasoja, plasmasytoosia ja immuunikompleksitautia ja oirekuva saattaa vaihdella oireettomasta tappavaan. Tauti havaittiin Pohjois-Amerikassa 1950-luvulla, mutta se on sittemmin levinnyt kaikkiin minkinkasvattajamaihin ja luontoon, jossa se infektoi useita näätä- ja koiraeläinlajeja. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia AMDV:n epidemiologiaa, evoluutiota, leviämistä ja patogeneesiä sekä kehittää PCR- ja sekvensointimenetelmiä avuksi taudin ymmärtämisessä ja kontrolloinnissa.
Päivitimme PCR diagnostiikkaa validoimalla kaksi käytössä ollutta SYBG green -pohjaista PCR-menetelmää sekä pystytimme uuden koetinpohjaisen PCR-menetelmän, joka otettiin sittemmin käyttöön diagnostiikassa. Lisäksi optimoimme kahta aiemmin julkaistua menetelmää kokonaisten virusgenomien sekvensointiin ja sekvensoimme kokonaisia virusgenomeja useista näytteistä.
Tutkimme turkistarhauksen vaikutusta AMDV:n evoluutioon ja leviämiseen analysoimalla viruskantoja turkistiloilta ja villieläimistä Suomessa ja Puolassa. Virussekvenssien perusteella AMDV on levinnyt molempiin maihin useassa erässä ja sekä maakohtaista ryhmittymistä että runsasta maiden välistä leviämistä oli havaittavissa. Sekvenssidata Puolasta vahvisti, että turkistarhaus vaikuttaa viruksen monimuotoisuuteen ja leviämiseen luonnossa. Havaitsimme myös runsaasti koinfektioita, rekombinaatiota ja poikkeuksellisen nopeaa evoluutiota.
AMDV-vasta-aineita verrattiin minkeissä ja muissa näätäeläimissä. Urokset olivat vasta-aine-positiivisia naaraita useammin ja aikuiset nuoria minkkejä useammin. Isompi osa minkeistä oli vasta-ainepositiivisia tilojen lähellä kuin kauempana tiloista viitaten viruksen leviämiseen tiloilta luontoon. Vasta-ainepositiivisten yksilöiden osuus muissa näätäeläimissä korreloi sen kanssa paljonko laji on kontaktissa minkin kanssa ja muut lajit näyttävät pääsevän viruksesta eroon minkkiä useammin.
Taudin vakavuuden vaihtelua tutkittiin vertaamalla AMDV-positiivista tolerantteja minkkejä vuosikymmeniä jalostanutta tilaa, jolla ei ollut juurikaan oireista tautia, tilaan, jolla oli oireilevia minkkejä sekä puhtaaseen tilaan. Oireilevilla minkeillä havaittiin merkittävästi enemmän virusta kudoksissa kuin oireettomilla. Tolerantteja minkkejä jalostaneella tilalla iso osa minkeistä oli vasta-aine-negatiivisia ja PCR-positiivisia 2,5 vuoden seurannan aikana viitaten hyvin matalaan vasta-ainetuotantoon. Transkriptominanalyysi paljasti eroja geeniekspressiossa tilojen välillä. Tulokset osoittavat, että minkit voivat elää AMDV:n kanssa vuosia ilman näkyviä oireita.
Näissä projekteissa päivitimme AMDV:n leviämisen kontrolloinnissa tärkeää PCR-diagnostiikkaa nopeammaksi ja luotettavammaksi sekä pystytimme metagenomisen menetelmän AMDV:n ja muiden ssDNA-virusten genomien sekvensointiin ilman tarkempaa tietoa virussekvenssistä. Lisäksi hankimme uutta tietoa viruksen epidemiologiasta, mikä mahdollistaa sen historian ja leviämisen paremman ymmärtämisen. Eri taudinkuvien vertailu puolestaan valotti AMDV:n patogeneesiä ja antoi uusia ulottuvuuksia taudin kontrollointiin
