En las últimas décadas, la inmensa mayoría de los programas de mejora genética de melocotonero se han enfocado en la obtención de variedades de maduración temprana o extratemprana...Colaboración en la web: Interempresas.ne

Espiau Ramírez, María Teresa

Rubio Cabetas, María José

citaREA Repositorio Electrónico Agroalimentario

Mª Teresa Espiau Ramírez, Ingeniero Técnico Agrícola; Técnico de InvestigaciónMª José Rubio Cabetas, Doctora en Biología; InvestigadoraUnidad de Hortofruticultura. Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria (C.I.T.A.) de Aragón26/09/20161017HORTICULTURALa técnica conjunta de cultivo de óvulos y de embriones puede ser la solución para lagerminación de embriones de un gran número de variedades de bajas necesidades dehoras frío, con baja viabilidad de por síEn las últimas décadas, la inmensa mayoría de los programas de mejora genética de melocotonero sehan enfocado en la obtención de variedades de maduración temprana o extratemprana, que por su altarentabilidad comercial son el objetivo prioritario en los países productores de melocotón de amboshemisferios. El uso y la explotación de las variedades élite y de líneas ya mejoradas ha reducidoMarcadoras IndustrialesSus Códigos en Cualquier Material! Inkjet,Etiquetado, Láser y Térmica. Ir avideojet.com/impresoras_videojet    El cultivo in vitro de embriones y óvulos en lamejora de variedades tempranas demelocotonero     considerablemente el tamaño del embrión en el momento de la madurez del fruto, lo que imposibilitala germinación de estas semillas con los métodos tradicionales. Desde los años 80 se viene utilizandoen estos programas de mejora el cultivo de embriones aislados por métodos arti ciales para conseguirla germinación de las semillas de este tipo de variedades. Por ello, en este artículo se hace una revisiónde los protocolos mejorados de cultivo de óvulos y subsiguiente cultivo de embriones para garantizaruna aceptable tasa de germinación, incrementar el número de plantas viables y así amortizar lainversión realizada y acortar tiempos dentro de los programas de mejora. Con estas técnicas se hanlogrado germinaciones cercanas al 100% a partir de embriones menores de 3 mm, redundando en lae cacia de los programas de mejora.IntroducciónLa mejora hacia variedades de bajas necesidades de frío comenzó ya en 1907 en Estados Unidos, primeroen la Universidad de California, y posteriormente en la Universidad de Florida. Otros paísestradicionalmente obtentores de variedades 'low chilling' de melocotonero son Sudáfrica, Brasil, Chile,Méjico y más recientemente se han incorporado Taiwán, Australia y Tailandia (TOPP et al., 2008). EnEspaña, 9 de los 13 programas de mejora activos en la actualidad, ubicados fundamentalmente en laszonas del sur (Valencia, Andalucía, Murcia y Extremadura) se enfocan hacia la obtención de variedadestempranas y extra-tempranas adaptadas a las condiciones Mediterráneas (Llácer et al., 2009).El principal obstáculo con el que se encuentran los mejoradores de melocotón y nectarina cuandotrabajan con parentales de maduración temprana, es la escasa o nula viabilidad de las semillas de estasvariedades cuando se germinan por métodos convencionales, es decir, por estrati cación húmeda ygerminación en semillero.Con la introducción de técnicas de cultivo de óvulos y embriones se puede lograr la obtención de plantasa partir de semillas inmaduras y por tanto mejorar enormemente la e ciencia de los programas demejora.Las técnicas in vitro aumentan los costes y requieren cierta especialización, pero reducen espacio ytienden a acortar los largos programas de mejora. Una vez implantada la técnica del cultivo de embriones,merece la pena abordar el cultivo de óvulos para los parentales más tempranos, optimizando al máximo latécnica para amortizar costes y alcanzar mayores porcentajes de germinación en el mismo año y, ende nitiva, obtener progenies con una maduración lo su cientemente temprana como para empezar elproceso de selección lo antes posible.Cultivo de embrionesLa técnica del cultivo de embriones permite rescatar el zigoto en diferentes estados de desarrollo ycompletar su crecimiento en un medio arti cial que le aporta las sales minerales, las vitaminas y losazúcares que necesita. Una vez colocado en el medio, el embrión aumenta de tamaño, es capaz degerminar y posteriormente la plántula puede ser transplantada a tierra de igual forma que se haría conuna planta procedente de semilla germinada in vivo (Rubio-Cabetas et al., 1997).La aplicación de esta técnica en cerezo (Tukey, 1933) permitió aumentar la baja tasa de germinación de lassemillas de variedades de maduración precoz de esta especie, pero Blake (1939) fue el primero enaplicarla en un programa de mejora genética de melocotonero. Smith, Bayley y Hugh (Smith et al., 1969)propusieron un protocolo y un medio de cultivo más adaptado al melocotonero (medio SBH), protocolo quea lo largo de los años se ha ido perfeccionando en cuanto a esterilización, medios de cultivo,estrati cación, condiciones de cultivo, etc. (Ramming, 1985, 1990; Emershad y Ramming, 1994), y que seanaliza paso a paso en el presente artículo.EsterilizaciónCon la intención de simpli car el método de esterilización para que fuese menos costoso y no implicarariesgos para los técnicos de laboratorio, Ramming (1990) consiguió un nivel de contaminacionesprácticamente nulo mediante la apertura del fruto y del hueso para la extracción de la semilla ( gura 1), yel  ameado de la misma dentro de la cabina de  ujo laminar tras inmersión en alcohol de 96º. Para evitarel daño del embrión durante el  ameado, éste debe hacerse con el extremo micropilar del embriónapuntando hacia el  ujo de aire de la cabina ( gura 2). Comparaciones de esterilización con lejía comerciala diferentes concentraciones con esterilización por  ameado mostraron una e cacia del 100% deembriones no contaminados tanto con lejía al 10% durante 20 minutos como con  ameado, obteniendo enambos casos germinaciones similares (Espiau, 1996). El  ameado es una técnica rápida y cómoda, y resultala más recomendable siempre y cuando se tenga cierta habilidad para no dañar el embrión, y un especialcuidado con el mechero y el alcohol para evitar accidentes de laboratorio.Figura 1. Apertura de los huesos para la extracción de la semilla en el cultivo de embriones.Figura 2. Flameado de la semilla con el extremo micropilar hacia la corriente de  ujo laminar para el cultivo de embriones.Medio de cultivoUna vez realizada la esterilización, el embrión, extraído de la semilla, se inserta en el medio de cultivo, conel micropilo hacia abajo ( gura 3).Aunque siempre se ha considerado que la composición del medio utilizado y el tamaño del embrión sonlos dos factores determinantes en el porcentaje de plantas germinadas que  nalmente sobreviven y sontransplantadas a tierra (Ramming, 1985; Sinclair y Byrne, 2003), realmente es más determinante para elporcentaje de germinación el tamaño del embrión que el medio de cultivo (Mansvelt et al, 2015).Con el medio WPM (Woody Plant Medium; Lloyd y McCown, 1975) se han logrado porcentajes cercanos al100% de plantas germinadas y una buena supervivencia de las mismas con embriones de entre 5-10 mm.,es decir, del 25-50% de ocupación de la semilla (Hamill et al., 2005). Cuando el tamaño del embrión essuperior a 10 mm., ocupando al menos el 75% de la semilla, el medio más adecuado parece ser el SBH(Smith et al., 1969).Figura 3. Embrión dentro del medio de cultivo.Estrati caciónComparando la estrati cación de embriones maduros de melocotonero a 4 °C durante 15, 30, 45, 60, 75 y90 días, se obtuvo mayor supervivencia de las plantas cuando la estrati cación fue de 60 días (Espiau,1996). Sin embargo, se observa una tendencia a reducir la temperatura a 1-1,5 °C y los tiempos a 45-60días (Ramming et al., 2003, Ramming, comunicación personal).Se ha comprobado que el almacenamiento en frío de los frutos previo a la extracción de la semilla tieneun efecto negativo sobre el crecimiento del embrión, la germinabilidad del mismo y la supervivencia delas plantas tras 3 semanas de almacenamiento de los frutos en frío (Anderson et al., 2006).Condiciones de cultivoUna vez que han pasado la fase de estrati cación, los embriones ( gura 4) se trans eren a una cámara decultivo, habitualmente a 24 ± 2 °C y con fotoperiodo de 12-16 h, aunque, se han observado mejoresresultados cuando la temperatura de cultivo se ha disminuido a 20 ± 2 °C, lográndose un aumento deentre un 13 y un 22% en la supervivencia de las plantas una vez implantadas estas condiciones en elprograma de mejora (Anderson y Byrne, 2002, Ramming, comunicación personal).Una vez que la raíz alcanza un tamaño más o menos grande, y antes de que comience a enroscarse dentrodel envase de cultivo, las plántulas se trans eren a tierra, requiriendo una progresiva aclimatación de lasmismas respecto de las condiciones arti ciales a las que ha estado sometido previamente, implantandoen este proceso unas condiciones de humedad del 99%.Figura 4. Embriones germinados en la cámara de estrati cación, para transferir a cámara de cultivo.Cultivo de óvulosLas variedades extra-tempranas de melocotonero y nectarina alcanzan tamaños de embrión en torno a 1mm cuando el fruto está maduro. La técnica anteriormente descrita de cultivo de embriones ha resultadoinadecuada cuando se trabaja con tamaños tan pequeños (Ramming et al., 2003), lo que sucede confrecuencia cuando se seleccionan parentales de maduración cada vez más temprana.Para superar este problema, Ramming (1985) combinó la técnica del cultivo de óvulos desarrollada porStewart y HSU (1977) con el cultivo de embriones para obtener plantas cuando el tamaño del embrión eramenor de 5 mm.La complejidad de la técnica y no tanto la baja germinabilidad han sido los mayores obstáculos para suimplantación en algunos programas de mejora.En los últimos años se han ensayado diferentes medios, tipos de soporte, orientaciones del embrión ytipos de recipiente, resultando en una técnica mucho más sencilla y alcanzando porcentajes del hasta90% de embriones germinados y transplantados a tierra (Ramming et al., 2003).EsterilizaciónTras eliminar el pedúnculo, los frutos se esterilizan mediante inmersión en etanol al 70% durante unminuto y lavado en hipoclorito de sodio al 0,525% con 0,01% de Tween 20 durante 10 minutos. Los frutosse abren dentro de la cabina de  ujo laminar, con tijeras esterilizadas con etanol al 70% ( gura 5)(Ramming et al., 2003).Figura 5. Apertura de los frutos (dentro de cabina de  ujo laminar), para la extracción de los óvulos.Medio de cultivo y soporteEn este estado, la composición nutritiva del medio de cultivo es de vital importancia, ya que el desarrollodel embrión es heterótrofo y para ello requiere, además, de una fuente más rica en azúcares y vitaminas.Aunque la adición de  tohormonas no ha resultado en un mayor crecimiento del embrión en ningún casoen melocotonero (Pinto et al., 1994), sí se logró una germinabilidad cercana al 100% con una supervivenciadel 60% de las plantas germinadas cuando se utilizó el medio SH (Steward y HSU, 1997) suplementado con6% de sacarosa, 3% de carbón activo y 0,65% de agar (Ramming et al., 2003).La supervivencia de las plantas germinadas ha sido siempre mayor cuando se ha sembrado el óvulo enorientación vertical, con el micrópilo hacia abajo e introducido en el medio hasta la mitad (Ramming et al.,2003)IncubaciónLos óvulos, una vez en el medio de cultivo ( gura 6), son incubados en oscuridad a 27 °C durante 30 días,condiciones en las que los embriones, en el interior, continúan su desarrollo (Ramming et al., 2003).Tras este periodo de incubación, los óvulos se extraen del medio ( gura 7), siempre en condicionesasépticas, se abren, y los embriones se trans eren a un medio SBH o WPM, según que el tamañoalcanzado dentro del embrión esté por encima o por debajo de 10 mm. (Rubio-Cabetas et al., 1997, Rubio-Cabetas y Espiau, 2010). A partir de aquí comienza la fase de cultivo de embriones tal y como se hadescrito anteriormente.Figura 6. Óvulo introducido en el medio de cultivo.Figura 7. Embrión desarrollado dentro del óvulo tras el periodo de incubación.ConclusionesCuando la maduración tiene lugar antes de 65 días después de la  oración (DDF) o el tamaño del embrión no suele superar los 5mm., se recomienda el uso de los dos pasos siguientes: cultivo de óvulos y posterior cultivo de embriones. Con maduracionesposteriores a los 65 DDF o cuando los embriones superan los 5 mm. de longitud, es su ciente con el cultivo de embrionesutilizando el medio WPM. Si la longitud supera los 10 mm, se utilizará un medio más básico, como el SBH.La técnica conjunta de cultivo de óvulos y de embriones puede ser la solución para la germinación de embriones de un grannúmero de variedades de bajas necesidades de horas frío, con baja viabilidad de por sí. Esta herramienta, utilizada paravariedades tempranas y extra-tempranas de Prunus y algunos híbridos interespecí cos, tiene un claro potencial para programasde mejora.Referencias bibliográ casANDERSON, N.; BYRNE, D.H., 2002. Cool temperature during germination improves germination and survival of embryocultured peach seed. Acta Hort. 592, 25-27.ANDERSON, N.; BYRNE, D.H.; RAMMING, D.W., 2006. In ovule culture success as affected by sugar source and fruitstorage duration for nectarine embryos. Acta Horticulturae. 713:89-92.BLAKE, M.A., 1939. Some results of crosses of early ripening varieties of peaches.EMERSHAD, R.C.; RAMMING, D.W., 1994. Effects of media on embryo enlargement, germination and plant development inearly-ripening genotypes of Prunus growth in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 37, 55-59.ESPIAU, M.T., 1996. Cultivo in vitro de embriones de variedades tempranas de Prunus persica y Prunus avium. Proyecto n de carrera. 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