Detection and identification of 'Candidatus Phytoplasma prunorum' in Prunus germoplasm

Abstract

The molecular characterization of the causal agent of diseases associated with several symptoms such as decline, yellowing, leaf roll and off-season growth in stone fruits made it possible to determine a common etiology, and the name ´European stone fruit yellows´ phytoplasma was proposed. Recently, the new taxonomical species description within the genus is 'Candidatus Phytoplasma prunorum'.A 2-yr survey was carried out in two different Prunus collections of the Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA) including European and Japanese plum genotypes of various species and several interspecific hybrids used as rootstocks. Both off-season growth in winter and decline were observed. In order to identify the phytoplasma suspected as a causal agent, two different PCR methods were applied to all inspected trees. The first method was a nested PCR with 16Sr X group-specific primers followed by RFLP analysis. The second method was a direct PCR with specific primers for 'Ca P. prunorum' (Eca1/Eca2). In the most symptomatic trees the presence of this phytoplasma was confirmed by at least one of the methods; negative results were obtained in asymptomatic trees. The nested PCR-RFLPs analysis was confirmed as a reliable method for routinary diagnosis rather than direct PCR.La caracterización molecular del agente causante de enfermedades asociadas a varios síntomas, como el enrollamiento clorótico, anticipación de la floración y la brotación, leptonecrosis o amarillamiento en los frutales de hueso permitió determinar una etiología común, el fitoplasma 'European stone fruit yellows', recientemente clasificado taxonómicamente como 'Candidatus Phytoplasma prunorum'. Durante dos años se llevó a cabo una prospección en dos colecciones del Centro deInvestigación y Tecnología Agroalimentaria (CITA) de Aragón, que comprende diferentes especies e híbridos interespecíficos, de origen europeo y japonés, dentro del género Prunus. Se observaron síntomas de anticipo de floración y brotación en invierno y cierto decaimiento. Con objeto de identificar al posible fitoplasma causante de la enfermedad se aplicaron dos métodos en todos los árboles inspeccionados. El primero fue una PCR anidada con cebadores específicos del grupo 16Sr X seguida de un análisis de los fragmentos de restricción por RFLP. El segundo método fue una PCR con cebadores específicos de 'Ca P. prunorum' (Eca1/Eca2). En los árboles más sintomáticos se confirmó la presencia de los fitoplasmas por uno de los dos métodos, obteniéndose resultados negativos en los árboles asintomáticos. El primer método resultó ser más fiable que la PCR directa como método de diagnóstico rutinario