Participación de factores de transcripción de la familia Rel/NF-kappa B en procesos de plasticidad y memoria

Abstract

La memoria de largo término y la plasticidad neuronal comparten varias características,incluyendo las fases temporales de mecanismos celulares y moleculares: la inducción requiere de un aumento de calcio intracelular, la persistencia temprana depende de la activación de quinasas y las etapas tardías necesitan de transcripción génica y de la síntesis de proteínas. Desde los primeros experimentos en los cuales se logro amnesia inhibiendo la síntesis proteica, se especula acerca de la función de factores de transcripción (FT) específicos, en la regulación de la expresión génica necesaria para la perdurabilidad tanto de fenómenos mnésicos como de la plasticidad neuronal. Este trabajo se concentro en dos aspectos de la función del FT NF-kappa B en la consolidación de la memoria de largo término y la plasticidad neuronal. El primer aspecto se refiere a la activación del FT luego de inducidos estos fenómenos, y el segundo a la conservación evolutiva de la función de esta vía de transducción desde crustáceos a mamíferos. Para los propósitos de este trabajo se evaluó la activación de este FT en tres modelos: la consolidación de la memoria de largo termina (MLT) en el cangrejo Chasmagnathus granulatus, un paradigma evitación inhibitoria en ratón y la inducción de potenciación de largo término in vivo de la vía perforante del hipocampo de ratón. La presencia de la vía de regulación transcripcional Rel/NF-kappa B, se determinó en el cangrejo por retardo electroforético (EMSA), Western Blot, inmunoprecipitación, unión covalente con irradiación ultravioleta e inmunohistoquímica. En el cangrejo, un protocolo que induce una MLT es seguido por una activación bifásica de unión al ADN por parte del NF-kappa B, mientras que un protocolo que induce una memoria de corto término no activa al FT. NF-kappa B se encuentra presente en las terminales sinápticas, en donde es activado por protocolos de entrenamiento que inducen MLT. El curso temporal de la activación de NF-kappa B nuclear en hipocampo, se estudió por EMSA, después del entrenamiento de un ensayo, en el paradigma de evitación inhibitoria en ratón. Mostrando, cuando se lo comparo con los animales naive, una inhibición del FT luego de 15 min. del entrenamiento seguida por una activación a los 45 min. tanto en los animales que sufrieron un shock eléctrico, como en los que fueron expuestos al contexto sin shock. En esta misma línea argumental, encontramos que la inyección intra cerebro ventricular (icv) de sulfasalazina inmediatamente post-entrenamiento impide la formación de la memoria de largo término. Más aún, una segunda estrategia independiente para inhibir el NF-kappa B en el cerebro, la administración icv de un oligonucleótido doble cadena de ADN conteniendo la secuencia consenso de NF-kappa B (kB Decoy) también resulta amnésica. Cuando se estudian los EMSAs de extractos nucleares de hipocampo de ratón, se observa que animales tetanizados (protocolo inductor de potenciación de largo término) muestran, luego de 15 min. un aumento en la actividad de unión al ADN, cuando son comparados con, animales estimulados a baja frecuencia (EBF) y animales naive. Los hipocampos al ser analizados por inmunohistoquímica con un anticuerpo contra la forma activa del factor, muestran la misma tendencia general pero con patrones celulares de activación más complejos. Estos resultados indican, primero que la actividad de unión al ADN del NF-kappa B es necesaria para la consolidación de memorias de largo término. Y el tratamiento con inhibidores específicos de NF-kappa B, suficiente para generar amnesia en los animales inyectados. A la vez que muestra un patrón temporal claramente delimitado en el cual el factor es necesario para la consolidación. Igualmente significativa es la activación del FT luego de inducida la plasticidad neuronal, mostrando un papel en el proceso de potenciación. El segundo aspecto de este trabajo sugiere que la vía de transducción señales de NF-kappa B se encuentra conservada, en su función fisiológica en el sistema nervioso, entre invertebrados y vertebrados.Long term memory and neural plasticity share several characteristics, including the temporal phases of molecular and cellular mechanisms: the induction requires an increment on intracellular calcium, early persistence depends on the activation of kinases and the late steps need gene expression and protein synthesis. Since the first experiments in which amnesia was produced by protein synthesis inhibition, it has been speculation about the role of specific transcription factors (TF) in the regulation of the gene expression needed for the lasting of mnesic processes such as neural plasticity. This thesis concentrates on two aspects of the function of TF NF-kappa B during long term memory consolidation and neuronal plasticity. The first, concerns it’s activation after the induction of these phenomena, and the second concerns the evolutionary conservation of this signaling pathway from crustaceans to mammals. For the purpose of this thesis, the activation of NF-kappa B was evaluated in three models: long term memory (LTM) consolidation in the crab Chasmagnathus granulatus, inhibitory avoidance in mice and the induction of in vivo long term potentiation, of the hipocampal perforant pathway in mice. The presence of the Rel/NF-kappa B transcriptional regulatory pathway in Chasmagnathus was studied by Electro Mobility Shift Assay (EMSA), Western Blot, Immunoprecipitation, Ultraviolet Crosslinking and Immunohistochemistry. In the crab, a protocol that induced LTM, is followed by a a bifasic activation of the DNA binding activity of the TF, while a protocol that induces short term memory does not activate NF-kappa B. This TF is present at the synaptic terminals, where it is activated by the LTM inducing training protocols. The temporal course of nuclear NF-kappa B activation in mice hippocampus, was studied by EMSA, after the one trial inhibitory avoidance training. Showing, when compared with naive animals, an inhibition 15 min. after training, followed by activation after 45 min., both in the animals that received shock and the ones only exposed to the context. In the same line of evidence, animals injected intra cerebro ventricular (icv) with sulfasalazine (an inhibitor of NF-kappa B activation) immediately after training impede the formation of LTM. What is more, an independent and more specific form of NF-kappa B inhibition, the icv injection of a double stranded DNA containing the TF consensus sequence (kB decoy), results amnesic. When we studied EMSAs of hippocampal nuclear extracts, tetanized mice (a protocol that induces potentiation) shows, 15 min after, an augment in DNA binding activity, in contrast with low frequency stimulated and naive mice. Immunohistochemical analysis with an antibody against the active form of the transcription factor, showed the same tendency but with a more complicated cellular pattern of activation within the hipocampal structure. These results indicate, first that the DNA binding activity of the TF is necessary for LTM and that the treatment with NF-kappa B specific inhibitors is sufficient to generate amnesia in the injected animals. At the same time it shows that a clear temporal pattern of activation is needed for consolidation. Equally significant is the activation of TF after the induction of neural plasticity, showing a role in this process. The second aspect suggested by this work, is that the Rel/NF-kappa B pathway is conserved in its physiological function between invertebrates and vertebrates.Fil:Freudenthal, Ramiro A.M.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina