Role of sulfated polysaccharides and herpes simplex virus type 1 variants in viral pathogenicity

Abstract

El virus Herpes simplex (HSV) es responsable de una variedad de manifestaciones clínicas desde ulceras oro-faciales y genitales hasta encefalitis y alteraciones respiratorias. Los síntomas son usualmente autolimitantes pero pueden ser extensivos y prolongados en individuos inmunocomprometidos. En estos casos, puede requerirse una larga terapia antiviral, lo que resulta en la generación de virus resistentes a las drogas como el aciclovir (ACV). El HSV ingresa a las células mediante una interacción primaria entre las glicoproteínas virales y el heparán sulfato (HS), molécula presente en la superficie celular y en la matriz celular. Los carragenanos (CGNs) son polisacáridos sulfatados derivados de algas rojas cuya estructura es similar a la del HS. Ellos actúan como inhibidores potentes y selectivos de HSV, al bloquear la interacción de virus con su receptor primario en la etapa de adsorción viral. En estudios previos realizados en nuestro laboratorio se seleccionaron y caracterizaron variantes virales de HSV-1 cepa F. Éstas fueron obtenidas bajo presión de selección con un CGN natural μ/n denominado 1C3 de estructura relacionada con los CGNs kappa (k) e iota (ɩ)-(1C3syn14-1 y 1C3syn17-2). A fin de evaluar la reproducibilidad del método utilizado para generar las variantes virales se realizaron pasajes seriados de HSV-1 cepa KOS en células Vero en presencia de concentraciones crecientes de CGN ɩ o heparina (H). Se seleccionaron 4 clones, ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 y H17-16, los cuales exhibieron características similares en: resistencia relativa al compuesto usado durante el tratamiento selectivo y al ACV, al igual que su curva de replicación viral. Además, fueron menos virulentos que la cepa patrón en ratones BALB/c por inoculación intravaginal pero no por vía intranasal, a excepción de la variante ɩ16-11 que fue atenuada por ambas vías. Por otro lado, se profundizó el estudio de la caracterización citopática y patogénica de las variantes virales, derivadas de HSV-1 F, en mucosa respiratoria. Se demostró la activa participación de los macrófagos como protagonistas en la patología viral y se la correlacionó con la menor activación de citoquinas inflamatorias (TNF-α, IL-6) en relación con la cepa control. Alteraciones puntuales detectadas en el gen de la glicoproteína D de las variantes virales podrían ser parte responsable de la liberación disminuida de citoquinas proinflamatorias. Mientras que las moléculas de adhesión VCAM e ICAM no se vieron afectadas. Por otro lado se mostró, que el procedimiento empleado usando CGNs permitió la selección y/o modificación de los genes de la Timidina Quinasa y la ADN polimerasa sin alterar la resistencia viral al ACV. El conjunto de estos resultados indican que la regulación de los niveles de las citoquinas TNF-α e IL-6 juega un rol importante en la patología respiratoria de HSV y además que el método utilizado de obtención de las variantes permite la selección de virus con características estables. Estos resultados contribuyen a la caracterización de las variantes virales con el objetivo de profundizar los conocimientos de la respuesta inflamatoria en el tracto respiratorio luego de una infección por HSV. Palabras Claves: virus Herpes simplex, Carragenanos, variantes virales, atenuación, inmunopatología.Herpes simplex virus (HSV) is responsible for a variety of clinic manifestations, from oro-facial and genital ulcers to encephalitis and respiratory disorders. Symptoms are usually self-limiting but they can be extensive and prolonged in immunocompromised patients. In these cases, it might be required a long antiviral therapy, resulting in the generation of drugresistant viruses such as Acyclovir-resistant viruses. HSV enters the cell by a primary interaction between viral glycoproteins and the heparan sulfate (HS), molecule present in the cell surface and cellular matrix. Carrageenans (CGN) are sulfated polysaccharides derived from red algae with a chemical structure similar to HS. CGN were identified as potent and selective inhibitors of HSV by blocking the interaction between the virus and HS during the adsorption. In previous studies carried out in our laboratory, viral variants from HSV-1 strain F were selected and characterized. They were obtained under selective pressure of the μ/n -1C3 natural CGN with a chemical structure related to the kappa (k) and iota (ɩ) CGNs (1C3syn14-1 and 1C3syn17-2). In order to evaluate the reproducibility of the method used to generate viral variants, serial passages were done with HSV-1 strain KOS in Vero cells in the presence of increasing concentrations of the ɩ CGN or heparine (H). Four clones were selected: ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 and H17-16, which exhibited similar characteristics such as relative resistance to the compound used for the selective treatment and ACV, as well as theirs viral replication curve. Furthermore, they were less virulent than the parental strain in BALB/c by intravaginal inoculation but not intranasally, except for the variant ɩ16-11 which was attenuated by both routes. On the other hand, the cytopathic and pathogenic effect of the viral variants, derived from HSV-1 F virus, were characterized in the respiratory mucosa. It was demonstrated that the active involvement of macrophages as key players in the viral pathology correlated with the lower release of the inflammatory cytokines (TNF-a and IL-6) in relation with the parental strain. Punctual mutations detected in the gene of glycoprotein D of the viral variants could be partially responsible for the low concentration of the inflammatory cytokines. Moreover, the expression of adhesion molecules VCAM and ICAM was not altered. It was also shown that the use of the CGN allowed the selection and/or modification of the Timidine Kinase and DNA polimerase genes without modifying resistance to ACV. All these results indicate that the regulation of TNF-a and IL-6 play a key role in the respiratory pathology of HSV and that the method used to obtain the viral variants allows the selection of virus with stable and attenuated characteristics. Results obtained in the present study contribute to characterize viral variants in order to extend the knowledge about the cellular inflammatory response induced in the respiratory tract by HSV-1. Keywords: virus Herpes simplex virus, Carrageenans, viral variants, attenuation, inmunopathologyFil:Artuso, María Carolina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina