Development of a plastidic expression system for the production of Human Papillomavirus E7 antigen in tobacco

Abstract

Durante este trabajo se obtuvieron distintas líneas de plantas de tabaco transplantómicas para el antígeno viral E7 del virus del papiloma humano (VPH). La capacidad del sistema plastídico para producir el antígeno viral fue verificada. Asimismo se comprobó que la proteólisis del péptido es el factor determinante de la expresión y principal limitante de los niveles de acumulación de la proteína recombinante. La modificación de las características intrínsecas del polipéptido mediante la fusión traduccional a otras proteínas como la cápside viral de PVX o la enzima β-glucuronidasa mostró ser una estrategia válida para reducir la tasa de degradación de E7. De esta forma se alcanzó un incremento de la expresión entre 5 y 10 veces superior a lo observado con E7 por masa de tejido. Sin embargo los mejores resultados se obtuvieron al reorientar la acumulación del antígeno viral hacia un entorno con características bioquímicas diferentes como es el lumen tilacoide. Por primera vez se logró translocar una proteína codificada por el plastoma a través de la membrana tilacoide utilizando una secuencia específica de la misma especie, la señal bipartita amino-terminal del gen OEC23 de tabaco. Los niveles de acumulación del antígeno en el tilacoide resultaron ser dos órdenes de magnitud superiores a los observados en el estroma. Los resultados de este trabajo muestran distintos abordajes basados en la utilización de plantas de tabaco transplastómicas como biorreactores para la producción de proteínas de interés inestables como E7 del VPH.In this work, different lines of transplantomic tobacco plants for the viral antigen E7 of human papillomavirus (HPV) virus were obtained. The plastid system capacity to produce the viral antigen was verified. Furthermore, we found that proteolysis of this peptide is the primary determinant of the expression and main limiting factor for recombinant protein accumulation. The modification of the intrinsic characteristics of the polypeptide by translational fusion with other proteins such as PVX coat protein or the enzyme β- glucuronidase proved to be a valid strategy to reduce the rate of E7 degradation. Using this strategy an increase in the expression from 5 to 10 times that of the observed value for E7 by tissue mass was achieved. However, the best results were obtained by redirecting the viral antigen into an environment with different biochemical characteristics such as the thylakoid lumen. For the first time, we achieved the translocation of a protein encoded by the plastoma across the thylakoid membrane by using a specific sequence from the same species, the bipartite signal amino-terminal of the OEC23 gene in Tobacco. Accumulation levels of the antigen in the thylakoid were two orders of magnitude higher than those observed in the stroma. The results of this work demonstrate different approaches based on the use of transplastomic tobacco plants as bioreactors for the production of unstable proteins of interest, such as E7 from HPV.Fil:Morgenfeld, Mauro Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina