Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Abstract
En la presente tesis, se abordó el clonado de la hsp70 de L.(V.) peruviana y la caracterización de la respuesta humoral en pacientes con Leishmaniasis Tegumentaria Americana, la Enfermedad de Chagas y la enfermedad mixta Chagas/Leishmaniasis. Se determinó el tamaño del inserto de U4 en 1,6 Kpb. Se mostró que U4 presentaba un marco de lectura abierto de 525 pb. que codifican para los 174 aminoácidos C-terminales de la hsp70 de L.(V.) peruviana. U4 presenta una homología de 98% con Lbb1 (97% de identidad y 1% de cambios conservativos) y con RA1 un 87% (74% de identidad y 13% de cambios conservativos). Se determinó la organización genómica de los genes hsp70 por Southern-blot de ADN genómico de clones de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis. Se encontró 2 locus genómicos, uno de los cuales contenía un tandem de genes hsp70 para ambas especies de Leishmania sp. Los ADNc de U4 y Lbb1 se subclonaron pGEX1l T para caracterizar la respuesta humoral en Leishmaniasis Tegumentaria Americana, Enf. de Chagas y la Inf. mixta Chagas/Espundia por Ensayo de Placa de Lisis, Western-blot y ELISA. Los resultados obtenidos por las 3 técnicas indican que U4/Lbb1 se pueden usar en el diagnóstico de L. Mucocutánea (Espundia) y junto a JL7, permitiría un diagnóstico diferencial de la enfermedad mixta Chagas/Espundia. El clonado y la caracterización de la respuesta humoral de las proteínas ribosomales P2 de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis. El clonado de las proteínas ribosomales ácidas de tipo P2 de L.(V.) peruviana y L.(V.) braziliensis se realizó mediante rastreo de bibliotecas de expresión en l gt11 con sondas de las proteínas ribosomales P2a y P2b de L.(L.) infantum. En la biblioteca de expresión de L.(V.) peruviana se aisló un recombinante con cada sonda. El recombinante LbpP2a tenía un inserto de aprox. 900 pb., presentando un marco de lectura abierto de 327 pb. que codifican 108 aminoácidos, faltándole sólo los 3 primeros residuos N-terminales para estar completa. El recombinante LbpP2a presenta una homología de aminoácidos de 95% (89% de identidad y 6% de cambios conservativos) con la proteína homóloga de L.(L.) infantum, un 87% (74% de identidad y 13% de cambios conservativos) con la de T. cruzi y un 65% (44% de identidad y 21% de cambios conservativos) con la proteína P2 humana. El otro recombinante (LbpP2b ) aislado de la misma biblioteca continua un inserto de 271 pb., presentando un marco de lectura abierto de 144 pb. que codifican los 44 últimos aminoácidos C-terminales. Cuando se compara el recombinante LbpP2b con sus homólogas de otras especies de Trypanosomátidos, la más alta homología la presenta con la proteína ribosomal P2b de L.(L.) infantum con un 90% (81% de identidad y 9% de cambios conservativos), con la P2b de T. cruzi alcanza un 86% (78% de identidad y 8% de cambios conservativos), con la P2b de T. brucei un 78% (66% de identidad y 12% de cambios conservativos) y con la P2 humana un 73% (59% de identidad y 14% de cambios conservativos). En la biblioteca de expresión de L.(V.) braziliensis se aisló un recombinante (LbbP2b -like) con la sonda la P2a de L.(L.) infantum. Este recombinante contiene un inserto de aprox. 750 pb., presentando un marco de lectura abierto de 264 pb. que codifican los 87 aminoácidos C-terminales de una proteína ribosomal P2b atípica de L.(V.) braziliensis. La comparación de aminoácidos es mayor con el recombinante LbpP2b con un 72% (52% de identidad y 20% de cambios conservativos), un 69% con la de L.(L.) infantum (49% de identidad y 20% de cambios conservativos), con la P2 humana un 64% (35% de identidad y 29% de cambios conservativos), con la T. brucei 58% (38% de identidad y 20% de cambios conservativos) y finalmente con la de T. cruzi un 53% (31% de identidad y 22% de cambios conservativos). Al analizar la respuesta humoral de pacientes con L. Mucocutánea contra los recombinantes LbpP2a y LbbP2b -like, se vió que el epítope inmunodominante no se localiza en el extremo C-terminal, mientras que en las proteínas ribosomales P de T. cruzi, se había determinado el extremo C-terminal como el epítope inmunodominante (péptido R-13). De otro lado, pacientes con la Enfermedad de Chagas no reaccionaban con las proteínas ribosomales de tipo P2 de Leishmania sp., indicando que inducen anticuerpos Leishmania-específicos y que no cros-reaccionan con las de T. Cruzi.I have performed the cloning of the hsp70 of Leishmania (Viannia) peruviana (recombinant U4) and characterization of the humoral inmune response in patients with American Tegumentary Leishmaniasis (ATL), Chagas’ disease (CH) and the mixed infection Chagas/Leishmaniasis (CH/L) against this protein. The recombinant U4 has an insert of 1,6 Kbp., presenting an open reading frame (ORF) of 525 bp, coding for the last 174 aminoacids. The recombinant U4 presents a high degree of homology with the recombinant Lbb1 (C-terminal domain of the hsp70 of L.(V.) braziliensis) of 98% (97% identity and 1% non conservative substitutions) and with the recombinant RA1 (C-terminal domain of the hsp70 of T. cruzi) of 87% (74% identity and 13% non conservative substitutions). I found two hsp70 genomic loci in the genome of the related species L.(V.) peruviana and L.(V.) braziliensis as determined by Southern blot. One locus comprised the tandem repeat of the hsp70 genes, which present a repetitive unit of 3,7 Kbp. I have cloned the U4, Lbb1 and RA1 cDNAs in the expression vector pGEX1l T to characterize the humoral inmune response in ATL, CH and CH/L as measured by ELISA, Phage dot array immunoassay and Western blot. I found a high reactivity of Mococutaneous Leishmaniasis sera with the U4/Lbb1 recombinant proteins, whereas most of the Cutaneous Leishmaniasis, Chagasic and non-related sera did not. I have also cloned the ribosomal P2-type proteins of L.(V.) peruviana (LbpP2a and LbpP2b ) and L.(V.) braziliensis (LbbP2b -like) by screening of the expression libraries with P2-type ribosomal proteins from L.(L.) infantum as probes. The recombinant LbpP2a has an insert of 900 bp. An ORF of 327 bp, codifying 108 aminoacids, lacking the three N-terminal residues to be a full length protein. This recombinant presents an homology of 95% (89% identity and 6% conservative substitution) with the homologous of L.(L.) infantum, 87% of homology (74% identity and 13% conservative substitutions) with the corresponding of T. cruzi and 65% of homology (44% identity and 25% conservative substitutions) with the human P2 protein. The recombinant LbpP2b has an insert of 271 bp, presenting on ORF of 144 bp, coding for the last 44 C-terminal aminoacids. It has an homology of 90% (81% identity and 9% conservative substitutions) with the corresponding of L.(L.) infantum, 86% of homology (78% identity and 8% conservative substitutions) with that of T. cruzi, 78% of homology (66% identity and 12% conservative substitutions) with the P2b protein of T. brucei and 73% of homology (59% identity and 14% conservative substitutions) with the human P2 protein. The LbbP2b -like protein has an insert of 750 bp, presenting an ORF of 264 bp. coding for the 87 C-terminal aminoacids. It has 72% of homology (52% identity and 20% conservative substitutions) with that of L.(V.) braziliensis, 69% (49% identity and 20% conservative substitutions) with that of L.(L.) infantum, 64% (35% identity and 29% conservative substitutions) with the human P2 protein, 58% (38% identity and 20% conservative substitutions) with the P2b of T. brucei and a 53% (31% identity and 22% conservative substitutions) with that of T. cruzi. In both Leishmania P2 proteins (LbpP2a and LbbP2b -like) evaluated, the most antigenic epitope was not located at the C-terminus, whereas in the T. cruzi P2 proteins the inmunodominant epitope was the last 13 C-terminal residues (R-13 peptide). Chagasic sera did not react with the ribosomal P2 proteins from Leishmania sp.Fil:Panebra Alvarado, Alfredo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
