Quantitative characterization of intracellular calcium signaling

Abstract

Las señales de calcio son utilizadas por una enorme variedad de células para regular procesos tan distintos como la fertilización o la muerte celular, entre muchos otros. La versatilidad del ión calcio como agente señalizador se basa en la gran diversidad de comportamientos que su concentración puede desplegar dentro de las células. Desentrañar la compleja trama de mecanismos que determinan dichos comportamientos es un enorme desafío que requiere la combinación de estrategias múltiples tanto experimentales como de modelado. En particular, el amplio rango de escalas espaciales y temporales involucradas no puede ser abarcado con un unico tipo de experimentos y es entonces que la elaboración de modelos que permitan conectar observaciones dispares se vuelve indispensable. Por otro lado, para que los modelos puedan cumplir este rol es necesario contar con estimaciones confiables, idealmente obtenidas in situ, de algunas de las cantidades que caracterizan a los fenómenos físicos y químicos involucrados en las señales. El objetivo de esta Tesis ha sido avanzar en la obtención de estas estimaciones realistas realizando experimentos opticos y desarrollando el marco teórico necesario para extraer información cuantitativa de los mismos. Una de las propiedades pobremente caracterizadas es la tasa a la que el calcio se transporta dentro de las células. Existen distintas técnicas opticas para estimar coeficientes de difusión, entre las que se encuentran la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) o la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP). La aplicación de las mismas al caso del calcio no es totalmente directa, ya que este ión no sólo difunde al entrar al citosol a través de canales específicos, sino que también reacciona con distintas sustancias (“buffers”) que poseen las células. Para describir este tipo de transporte es posible definir coeficientes efectivos, que contienen información sobre la difusión y las reacciones. Estudios preliminares habrán mostrado la existencia de más de un coeficiente de este tipo. Una de las contribuciones de esta Tesis ha sido estudiar de forma detallada la información que es posible extraer a partir de experimentos de FCS en donde la sustancia observada difunde y reacciona. En particular, se demostró que las técnicas de FCS y FRAP brindan información sobre coeficientes distintos, que puede ser combinada para inferir tasas de reacción yo de difusión libre. Se realizó este estudio teórico para el caso en que la sustancia de interés está marcada fluorescentemente y cuando existen moléculas marcadas y no marcadas en el mismo sistema. Parte de los resultados fueron aplicados para explicar las diferencias observadas en experimentos de FCS y FRAP, realizados para deter minar el coeficiente de difusión del producto del gen bicoid en embriones de moscas Drosophila melanogaster, una sustancia fundamental para el establecimiento del eje dorsoventral en este organismo. La aplicación de técnicas opticas para estudiar el transporte de calcio en células presenta dificultades adicionales. En primer lugar, la observación de la distribución del calcio se hace de modo indirecto, mediante fluoróforos que reaccionan con este ión y cambian sus propiedades espectrales como por ejemplo, aumentar notablemen te la fluorescencia al ligar calcio. Es decir, la sustancia observable (indicador ligado a calcio) está permanentemente transformándose en otra. Por otro lado, para poder inferir a partir de ella la distribución de calcio libre es necesario conocer propiedades del indicador que típicamente no son provistas por quienes lo comercializan, como por ejemplo, los coeficientes de difusión. Otra de las contribuciones de esta Tesis ha sido establecer las bases para la determinación de los coeficientes de difusión y tasas de reacción del calcio y sus fluoróforos, en células. Para tal fin se hicieron, en primer lugar, experimentos de FCS en distintos tipos de soluciones conteniendo calcio e indicador. Se trabajó simultáneamente en los desarrollos teóricos necesarios para el análisis de los mismos. De su aplicación se pudieron determinar coeficientes de difusión y parámetros de reacción en solución. Entre los experimentos se realizó un subconjunto conteniendo calcio, indicador y un “buffer” adicional. A partir del estudio detallado de estos ultimos se elaboró una propuesta de cómo obtener estos coeficientes en células intactas donde las propiedades de los “buffers” presentes son desconocidas. La versatilidad de las señales intracelulares de calcio depende, entre otras cosas, de la distribución espacial y de la cinética de los canales a través de los cuales los iones ingresan al citosol. Entre estos, los receptores de inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3 R) constituyen una de las vías más importantes para este ingreso. Estos canales se encuentran en la membrana del retículo endoplasmático organizados en cúmulos que se supone son de unos 100 nm de lado y que están, a su vez, separados por algunos milímetros entre sí. Los canales se abren cuando ligan calcio e IP3 R el que, en condiciones fisiológicas, es sintetizado a partir de elementos presentes en la membrana plasmática cuando la célula recibe una señal. La distribución inhomogénea de los canales junto con el efecto del calcio liberado sobre la probabilidad de aper- tura se combinan para dar lugar a una jerarquía de señales que van desde las muy localizadas hasta las ondas que viajan por toda la célula. Contar con información cuantitativa sobre la geometría de los cúmulos y sobre la cinética de los canales in situ es fundamental para entender la variedad de señales que pueden evocarse. Experimentalmente es posible observar las señales usando los fluoróforos antes mencionados e induciendo la apertura de los canales con IP3 , que es introducido en la célula en forma enjaulada y posteriormente fotoliberado con luz ultravioleta. Otra de las contribuciones del presente trabajo de Tesis ha sido el diseño e implementación de una adaptación relativamente barata de un microscopio confocal Olympus FV1000 para realizar este tipo de experimentos. La habilidad del sistema para fotolizar compuestos enjaulados fue comprobada en distintas situaciones experimentales. Por otro lado, la potencia que llega a la muestra y el tamaño de la zona iluminada fueron cuantificados. Finalmente, en el trabajo se ha mostrado también que con esta adaptación es posible generar un est ́mulo preciso y controlado de IP3 simultáneamente a la obtención de imágenes confocales de señales de calcio, registrando y caracterizando a las mismas en ovocitos de Xenopus Laevis.Calcium signals are used by an enormous variety of cells to regulate processes as diverse as fertilization or cell death, among others. The versatility of calcium as a signaling agent is based on the great diversity of behaviors that its concentration can display inside cells. Unveiling the complex network of mechanisms that determine these behaviors is an enormous challenge that requires the combination of multiple strategies which include experiments and modeling. In particular, the wide range of spatial and temporal scales involved can not be covered with a single type of expe- riment, so that the development of models that can connect different observations becomes unavoidable. On the other hand, for models to fulfill this role is necessary to have reliable estimates, ideally obtained in situ, of some of the quantities that cha- racterize the physical and chemical phenomena involved in the signals. The aim of this Thesis has been to advance in obtaining these realistic estimates by performing optical experiments and developing the theoretical framework necessary to extract quantitative information from them. One poorly characterized property is the rate of calcium transport inside cells. There are several optical techniques to estimate diffusion coefficients, among them, Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) and Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Applying these techniques to the case of calcium is not entirely straightforward, since this ion not only diffuses, when it enters the cytosol through specific channels, but also reacts with various substances (“buffers”) inside cells. Effective coefficients can be defined to describe this type of transport, which contain information on the diffusion and reaction parameters. Preliminary studies had shown the existence of more than one of these coefficients. One contribution of this Thesis has been a detailed study of the information that can be obtained from FCS experiments in which the particles observed diffuse and react. In particular, it was proved that FCS and FRAP provide information about different coefficients which can be combined to infer reaction and free diffusion rates. A theoretical study was done for the case in which the molecule of interest is fluorescently labeled and when there are fluorescently labeled and unlabeled molecules in the same system. Part of the results were applied to explain the differences observed in FCS and FRAP experiments, performed to determine the diffusion coefficient of bicoid in Drosophila melanogaster embryos, an essential substance for the formation of the dorsoventral axis in this organism. The application of optical techniques to study calcium transport in cells offers additional difficulties. First of all, the observation of the calcium distribution is indirect, by means of fluorophores that react with this ion and change their spectral properties upon binding (e.g. increasing their fluorescence when they are bound to calcium). Thus, the observable particle (indicator bound to calcium) is permanently transforming into another. On the other hand, to infer the distribution of free cal- cium it is necessary to know indicator properties that are not usually provided by the vendor, for example, diffusion coefficients. Another contribution of this Thesis has been to establish the basis for the determination of diffusion coefficients and reaction rates of calcium and fluorophores in cells. To this aim, firstly, FCS experiments in different types of solutions containing calcium and indicator were performed. At the same time, the theoretical framework for the analysis of the results was developed. Applying this theory, diffusion coefficients and reaction parameters could be deter- mined for the experiments in solution. Among the experiments, a subset containing calcium indicator and an additional buffer was performed. From a detailed study of the latter, a proposal was made on how to obtain these coefficients and parameters in intact cells where the properties of the endogenous buffers are unknown. The versatility of intracellular calcium signals depends, among other things, on the spatial distribution and kinetics of the channels through which the ions enter the cytosol. Among them, the inositol (1,4,5)-triphosphate receptors (IP3 R) are one of the most important ways for this entry. These channels are located on the mem- brane of the endoplasmic reticulum, organized in clusters of about 100 nm in side which are separated by a few millimeters. These channels become open when they bind calcium and IP3 which, under physiological conditions, is synthesized from elements present in the plasma membrane upon the arrival of a signal. The inhomogeneous distribution of the channels together with the effect of the free calcium on the open probability are combined to give rise to a hierarchy of signals, ranging from very localized ones to waves that travel throughout the cell. Having quantitative information on the clusters geometry and channels kinetics it in situ is essential for understanding the variety of signals that can be evoked. Experimentally, it is possible to observe these signals using the fluorophores mentioned before and indu- cing the opening of IP3 receptor/channels by introducing a caged form of IP3 into the cell and then fotoreleasing it with ultraviolet light. Another contribution of this Thesis has been the design and implementation of a relatively inexpensive adapta- tion of an Olympus FV1000 confocal microscope to perform such experiments. The system’s ability to photolyze caged compounds was tested in different experimental situations. The power that reaches the sample and the size of the illuminated area were also quantified. Finally, in this work it has also been demostrated that with the modified microscope it is possible to generate a precise and controlled IP3 stimulus, simultaneously with the confocal imaging of the evoked calcium signals. This has been proved by recording and characterizing such images in Xenopus laevis oocytes.Fil:Sigaut, Lorena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina