Recognition mechanism of an intrinsically disordered epitope by a monoclonal antibody: mechanistic and structural integration

Abstract

El reconocimiento de antígenos por medio de anticuerpos es un evento fundamental en la respuesta inmune adaptativa. A su vez la formación de los complejos Antígeno:Anticuerpo es extensivamente utilizada como modelo de estudio de interacción proteína-proteína. En la presente tesis estudiamos el mecanismo de reconocimiento de un anticuerpo monoclonal específico, M1, por la proteína E7 del papilomavirus humano (HPV). E7 es la oncoproteína que constituye la principal actividad transformante del virus y además es paradigma de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). E7 se expresa constitutivamente en tejidos de carcinoma y la aparición de anticuerpos específicos ocurre con alta frecuencia en pacientes con cáncer cervical. Llevando a cabo un mapeo epitópico determinamos que el anticuerpo M1 reconoce específicamente una región inmunodominante de la proteína de HPV- 16 denominada “bisagra”, por conectar el dominio IDP N-terminal con el dominio globular Cterminal de la misma. Experimentos cinéticos mostraron que la región reconocida por M1, la cual posee dos residuos de prolina, comprende al menos dos poblaciones separadas por una alta barrera energética (~ 22 Kcal/mol). Los estudios de Resonancia Magnética Nuclear identificaron el origen de esta barrera como un evento de isomerización cis-trans de las prolinas presentes en el epítope de reconocimiento. Se determinó que el anticuerpo M1 reconoce específicamente al epítope en su conformación minoritaria (10%), que posee sus prolinas en cis, mediante el mecanismo de selección conformacional. Por lo tanto, se requiere que el 90% de las moléculas que se encuentran en configuración trans isomericen previo a la unión con el anticuerpo. La velocidad de asociación del conformero cis por M1 ( kon = 6 x 107 M-1 s-1) se encuentra entre las más rápidas para las interacciones Antígeno:Anticuerpo, a pesar de que la reacción global es extremadamente lenta (t1/2 ~ 4 min). Esto indica que la reacción de asociación se encuentra limitada por un evento de isomerización de prolina. Utilizando mutantes puntuales demostramos que la P41 en su conformación cis es la requerida para la unión con el anticuerpo. Luego del evento lento de pre-equilibrio y de la unión con M1, ocurre un evento de rearreglo unimolecular, formándose finalmente un complejo consolidado de alta afinidad (KD 120 nM). Nuestros resultados sugieren que la presentación de este epítope viral por las células presentadoras de antígeno tiene que haber estado en su configuración minoritaria cis, al generar el clon que produce el anticuerpo específico. Finalmente, mostramos la importancia de los determinantes estructurales presentes en regiones desordenadas en el reconocimiento entre macromoléculas. Dado que numerosas proteínas virales son multifuncionales debido a su naturaleza IDP, los resultados presentados en esta tesis sientan la bases para el análisis del mecanismo de reconocimiento por medio de anticuerpos de epítopes virales intrínsecamente desordenados.Recognition of antigens by antibodies is a critical event in the adaptive immune response. Furthermore, the Antigen:Antibody complex is extensively used as a model of protein-protein interactions. In the present thesis, we present a detailed mechanistic study of the interaction between a specific monoclonal antibody, M1, with the E7 oncoprotein of human papillomavirus. E7 is the main transforming factor of this virus and also emerges as a paradigmatic example of an intrinsically disordered protein or IDP. E7 is constitutively expressed at high levels in carcinoma tissues and antibodies are frequently raised in patients with cervical cancer. Epitope mapping studies reveal that the M1 antibody specifically recognizes an immunodominant region of the HPV-16 E7 protein called "hinge", located between the IDP N-terminal and the globular C-terminal domains of the protein. Kinetic experiments show that this hinge, which has two proline residues, has at least two populations separated by a high energy barrier (~ 22 kcal / mol). Nuclear magnetic resonance traced the origin of this barrier to a very slow trans/cis prolyl isomerization event present in E7 epitope. The less populated (10%) cis isomer is the binding-competent species. Thus, the 90% of the molecules in the trans configuration require isomerization before binding. The association rate for the cis isomer approaches 6x107 M-1s-1, a ceiling for antigen-antibody interactions, although the overall reaction is extremely slow (t1/2 ~ 4 min). Therefore, the E7 epitope:M1 antibody complex formation is limited by a proline isomerization event. Mutagenesis experiments showed that Pro 41 in the epitope was required for both binding and isomerization. After the slow pre-equilibrium event and M1 binding, a post-binding unimolecular event occurs and a consolidated complex with a KD = 1.2!10-7 M is reached. Our results suggest that presentation of this viral epitope by the antigen presenting cells would have to be “locked” in the cis conformation in opposition to the most populated trans isomer in order to select the specific antibody clone. Finally, we show the importance of the structural determinants within disordered regions in the recognition mechanism between macromolecules. Many viral proteins are multifunctional due to its IDP nature. Therefore, the results presented in this thesis establish the basis for the analysis of the recognition mechanism by antibodies of intrinsically disordered viral epitopes.Fil:Fassolari, Marisol. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina