IBELLI, A. M. G.

LEDUR, M. C.

MARCHESI, J. A. P.

PANDOLFI, J. R. C.

PEIXOTO, J. de O.

PETRY, B.

ZANELLA, R.

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   13  7ª Jornada de Iniciação Científica - JINC 24 de outubro de 2013  Concórdia,SC COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE HOMOGENEIZAÇÃO CELULAR E CONGELAMENTO PARA EXTRAÇÃO DE RNA  Bruna Petry¹*; Ricardo Zanella²; Adriana Mércia Guaratini Ibelli3;  Jorge Augusto Petroli Marchesi4; José Rodrigo Claudio Pandolfi5;  Mônica Corrêa Ledur5 e Jane de Oliveira Peixoto5 ¹Graduanda em Ciências Biológicas, Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus de Joaçaba,  Bolsista PIBIC/CNPq - Embrapa Suínos e Aves, e-mail: bruuna_petry@gmail.com ²Bolsista BJT/CNPq - Embrapa Suínos e Aves  3Analista da Embrapa Suínos e Aves 4Universidade do Contestado 5Pesquisador da Embrapa Suínos e Aves  Palavras-chave: RNA, extração de ácidos nucléicos, expressão gênica.  INTRODUÇÃO A extração de DNA e RNA é uma das principais e mais importante etapas para a realização da maioria das metodologias utilizadas na biologia molecular. As amostras podem ser obtidas dos mais diversos tecidos e células e para que a extração possa ser feita, há uma infinidade de protocolos e reagentes que podem ser utilizados nesses procedimentos (2). Através de análises de RNA várias informações importantes sobre a expressão gênica e caracterização de transcritos podem ser obtidas, desde que o RNA seja extraído e purificado eficientemente, mantendo sua integridade e qualidade (1). Por isso, uma das maiores preocupações durante a extração do RNA é a sua degradação pela ação de ribonucleases (RNAses), que são enzimas altamente resistentes a diversos tratamentos, inclusive térmicos. Após a coleta, uma das etapas chave na extração de RNA é a maceração e lise dos tecidos ou células e as condições em que estes são submetidos (4). Dessa maneira, o objetivo deste trabalho foi comparar dois métodos de disrupção de tecidos, sob condições de resfriamento e congelamento, em amostras provenientes de ossos de aves.  MATERIAL E MÉTODOS Amostras de ossos de galinha da população TT da Embrapa Suínos e Aves foram coletadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. Após, estas amostras foram mantidas em freezer -80ºC até o início dos testes. Aproximadamente 100 mg de tecido foram submetidos à quatro procedimentos de extração de RNA com Trizol (Invitrogen) (2). Nos protocolos 1 e 2, as amostras congeladas foram retiradas para extração e mantidas em nitrogênio líquido até a adição de Trizol. Nos protocolos 3 e 4  as amostras foram  descongeladas e mantidas em gelo por aproximadamente 10 minutos até a adição do Trizol. Antes de iniciar a extração, as amostras dos protocolos 1 e 3 foram maceradas em almofariz de porcelana contendo nitrogênio líquido, enquanto que as dos protocolos 2 e 4 foram colocadas em Eppendorf 1,5mL contendo 1 mL de Trizol, esferas de aço inoxidável de 3.2 mm e colocadas no disputor de tecidos Bullet Blender, durante 5 minutos a velocidade 5. Após, a extração foi realizada com o protocolo padrão do Trizol (Invitrogen). A verificação da quantidade e pureza do RNA foi feita em espectrofotômetro Nanodrop e a qualidade foi verificada em gel de agarose 1% e em equipamento Bioanalyzer. A fim de verificar a influência do tipo de protocolo utilizado em estudos de PCR quantitativo, o cDNA das amostras dos 4 protocolos foi sintetizado a partir de 3 µg de RNA e então foram feitas reações de PCR em tempo real no equipamento 7500 SDS (Applied Biosystems) para os genes constitutivos HPRT1, RPLP1, GAPDH, HBMS e RPL30. O Ct (threshold cycle) foi obtido e as variações entre os protocolos foram avaliadas. Foram considerados os melhores protocolos aqueles que obtiveram os menores Cts.   RESULTADOS E DISCUSSÃO Como pode ser observado no gel de agarose 1% (Fig.1A), as amostras dos protocolos que permaneceram congeladas em nitrogênio líquido até a adição do Trizol (1 e 2) e do protocolo 3 que foi mantida em gelo e macerada em cadinho apresentaram as bandas de RNA ribossomal 28 e 18S nítidas, indicando que o RNA estava íntegro após as extrações. Já para o protocolo 4 mantido em gelo e homogeneizado em bullet blender, foi observada degradação parcial do RNA. Resultados semelhantes foram obtidos pela análise realizada em equipamento Bioanalyzer (Fig.1B), que utiliza eletroforese microfluídica e um algoritmo para verificação da qualidade do RNA (RIN). Nesta última análise, as amostras 1 e 3 apresentaram RIN maior que 8.0, indicando alta qualidade e integridade do RNA (Tabela 1). Em estudo semelhante, Carter et al. (2012) também observaram que ao usar amostras em temperatura próxima ao congelamento, o rendimento da extração do RNA era maior (3). Quando se    14  7ª Jornada de Iniciação Científica - JINC 24 de outubro de 2013  Concórdia,SC observou os resultados da qPCR, (Tabela 1) foi possível concluir que as amplificações das amostras do protocolos 1 e 3, seguido pelo protocolo 2 foram melhores, ou seja, apresentaram os Cts menores, diferentemente do que ocorreu com as amostras do protocolo 4, que teve amplificação tardia para todos os genes avaliados. Isso indica que o descongelamento, associado à homogeneização de tecidos em solução, pode prejudicar a qualidade do RNA e, consequentemente, as análises de RT-PCR em tempo real.  CONCLUSÕES Amostras que serão utilizadas para extração de RNA devem ser mantidas congeladas (em -80ºC ou nitrogênio líquido) por todo período antes da sua utilização, incluindo o período de disrupção dos tecidos. O descongelamento, associado à homogeneização dos tecidos em solução deve ser evitado, pois compromete a qualidade do RNA e consequentemente as análises de expressão gênica.  REFERÊNCIAS 1. IBELLI, A.M.G.; REGITANO, L. C. A.; MÉO, S. C. Extração de RNA  in Técnicas de Biologia Molecular Aplicadas a Produção Animal. São Carlos, SP. Embrapa Pecuária Sudeste, 2009. p.11-13. 2. IBELLI, A. M. G.; REGITANO, L. C. de A.; NICIMURA, S. C. M. Extração de RNA. In: REGITANO, L. C. de A.; NICIURA, S. C. M.; IBELLI, A. M. G.; GOUVEIA, J. J. de S. Protocolos em biologia molecular aplicada à produção animal. São Carlos: Embrapa Pecuária Sudeste, 2007. p. 9-13.  3. CARTER, L. E.; KILROY, G.; GIMBLE, J. M.; FLOYD, E. An improved method for isolation of RNA from bone. BMC Biotechnology. 12:5, 2012. 4. Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes. BG581 – GENÉTICA MOLECULAR 2011. Instituto de Biologia. UNICAMP, SP.     Figura 1. (A) Resultado das amostras em Gel de Agarose 1% e em equipamento Bioanalyzer (B)   Tabela 1. Resultados da quantidade (concentração em ng/µL) e qualidade (razão 260/280) de RNA medida em Nanodrop e no Bioanalyzer (integridade – RIN) e valores de Ct obtidos para cada um dos genes nas reações de qPCR Amostras Concentração  (ng/µL) Razão (260/280) RIN Valor de Ct HPRT1 RPLP1 GAPDH HBMS RPL30 Protocolo 1 1069.3 1.84 9.2 20.18 16.32 19.32 20.07 16.82 Protocolo 2 717.0 1.82 7.2 22.10 17.83 19.30 23.05 19.92 Protocolo 3 1280.0 1.95 9.0 20.65 16.33 16.60 22.03 17.11 Protocolo 4 2822.4 1.81 3.2 25.56 20.58 21.63 27.92 21.92      A1          A2        A3        A4  M      A1     A2     A3     A4 28S  18S   5S B A 

Comparação de métodos de homogeneização celular e congelamento para extração de RNA.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/973908/1/final7357.pdf

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