AUER, C. G.

GOMES, N. S. B.

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III EVENTO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA Embrapa Florestas Colombo – 06 a 08 de dezembro de 2004   007  MEIO SELETIVO PARA ISOLAMENTO DE Armillaria sp.1  Nei Sebastião Braga Gomes2Celso Garcia Auer3 RESUMO  Este trabalho apresenta um meio seletivo capaz de isolar Armillaria sp. O meio seletivo foi baseado no meio BDA (Batata-Dextrose-Ágar) suplementado com benomyl, cloranfenicol, ácido láctico, etanol e rosa bengala. Com este meio prático e barato, o patógeno pode ser isolado de fragmentos de casca, placas miceliais e rizomorfas ativas, coletadas de árvores doentes de Pinus spp.  INTRODUÇÃO  Os estudos laboratoriais com o fungo basidiomiceto Armillaria sp., agente causal da podridão de raízes em Pinus, têm sido feitos com isolados obtidos de material doente. O isolamento deste fungo, em meio de cultura, pode se tornar difícil devido ao seu crescimento lento, que facilita a sobreposição das culturas por contaminantes (fungos e bactérias) de crescimento mais rápido. Assim, o isolamento de Armillaria necessita de meios seletivos contendo substâncias inibidoras dos contaminantes (fungicidas e bactericidas) que não tenham efeito sobre o patógeno e de outras substâncias que ativem seu crescimento, para assim tornar-se mais fácil sua recuperação a partir dos tecidos doentes de plantas.  A escolha ou o desenvolvimento de um meio específico para isolamento de patógenos de plantas baseia-se nas qualidades que este possa apresentar em inibir os competidores pelo substrato, os contaminantes indesejados, e pela melhoria no isolamento e na diferenciação seletiva do patógeno em estudo (Lockwood, 1977).  Princípios ativos como orto-fenilfenol, pentacloronitrobenzeno, vancomicina, pimaricina, benomyl, sulfato de estreptomicina e outros têm sido empregados para isolamento de basidiomicetos de solo e madeira, pelas propriedades inibitórias aos contaminantes (Tuite, 1969). Certos agentes antimicrobianos utilizados nos meios de cultura apresentam o inconveniente de serem de difícil aquisição, seja pela ausência no mercado ou pelo custo elevado. Muitas vezes, tais substâncias necessitam ser importadas.  Os meios BDA e Malte-Ágar podem ser empregados para o isolamento de Armillaria, porém precisam ser acidificados ou suplementados com fungicidas (Morrison et al., 1991). O meio de Kuhlman-Hendrix que era empregado para o isolamento de Heterobasidion annosum, também foi recomendado para Armillaria (Kuhlman & Hendrix, 1962), porém várias substâncias não existem mais no mercado. Com base nas poucas informações sobre meios                                                           1 Parte da tese em desenvolvimento na Embrapa Florestas 2  Doutorando do Curso de Pós-Graduação em Engenharia Florestal, Universidade Federal do Paraná. Bolsista do CNPq. 3 Pesquisador da Embrapa Florestas auer@cnpf.embrapa.br  2seletivos para Armillaria, decidiu-se desenvolver um meio seletivo tendo como base o meio BDA suplementado de agentes antimicrobianos de fácil aquisição.  MATERIAL E MÉTODOS  Os estudos iniciais de isolamento de Armillaria sp., a partir de tecidos doentes de P. elliottii e P. taeda, foram feitos com os meios BDA (batata-dextrose-ágar), Malte-Ágar, meio de Martin Modificado e meio de Kuhlman-Hendrix, segundo formulações descritas por Tuite (1969). Com os meios BDA ou Malte-Ágar, houve elevada contaminação com fungos pertencentes aos gêneros Aspergillus, Penicillium e Trichoderma e bactérias do gênero Bacillus. Quando se utilizou o meio de Martin Modificado houve diminuição na contaminação bacteriana, entretanto surgiram as colônias de Trichoderma. O meio de Kuhlman-Hendrix permitiu o isolamento e cultivo de Armillaria, porém com freqüência ainda houveram contaminações fúngicas.  Para superar os problemas de contaminação por fungos adicionou-se ao meio o fungicida benomyl e o corante rosa bengala, de caráter fungistático. Contra as bactérias, utilizou-se cloranfenicol e ácido láctico bactericida. Etanol foi adicionado ao meio, por ser um potente estimulador do crescimento micelial e da produção de rizomorfas de Armillaria. Este fungo pode metabolizar ou tolerar estes compostos, que de outro modo inibem os principais contaminantes durante o isolamento (Garraway et al., 1991). As concentrações dos produtos químicos empregadas foram estabelecidas a partir de informações da literatura, de modo a reunir vários princípios ativos tóxicos aos contaminantes, inócuos para a Armillaria.  Para a preparação do meio seletivo, usou-se infuso de 200 g de batata picada, 20 g de dextrose e 20 g de ágar (constituintes do meio BDA), ao qual adicionou-se 3,3 mg de rosa bengala, 20 mg de benomyl, 250 mg de cloranfenicol, 10 ml de etanol 96 ° G.L. e 1 ml de solução de ácido láctico a 25 %, completando-se o volume a 1000 ml de água destilada. Todos os ingredientes foram misturados antes da autoclavagem (120 °C, 1 atm., 15 min.). O meio foi vertido em placas de Petri, tubos de ensaio e vidros de penicilina para verificar a viabilidade de uso. Para testar a eficiência do meio, fragmentos de tecidos doentes, rizomorfas e de placas miceliais foram retirados de plantas doentes de P. elliottii, P. taeda e de outros hospedeiros de Armillaria e transferidos para as placas, tubos e vidros de penicilina contendo o meio em teste.  Também, pode ser utilizado do caldo de batata mais dextrose e ágar já pronto, comumente denominado de Potato-Dextrose-Agar ou Caldo de Batata-Dextrosado com os mesmos produtos (fungicida e antibióticos).  As placas e outros recipientes com o meio foram incubados na temperatura de 22 °C, dentro da faixa de temperatura considerada ótima (15 a 25 °C) para Armillaria sp. determinada por Gomes et al. (2002), por um período de dois meses, a fim de analisar o comportamento do patógeno e dos contaminantes presentes, frente ao novo meio.   2 3RESULTADOS  O meio elaborado foi mais eficiente na inibição de Trichoderma spp. e de Bacillus spp., permitindo uma melhoria na obtenção de isolados de Armillaria sp., frente ao meio BDA e Meio de Martin Modificado. Com este meio pode-se isolar facilmente o fungo a partir de fragmentos internos de casca doente, de placas miceliais do patógeno na entre-casca da árvore e de rizomorfas ativas. As culturas jovens apresentaram crescimento lento, típico de culturas de Armillaria, com coloração inicialmente clara passando a escura, com liberação de exsudatos escuros na forma de halo ao redor da colônia e profusa produção de rizomorfas. Verificou-se que, as colônias eram menores que as obtidas em meio BDA, porém com grande produção de rizomorfas. Em alguns isolados, as rizomorfas surgem primeiro e a colônia se estabelece depois. O importante é formam-se colônias puras para posterior cultivo e manutenção em BDA ou Malte-Ágar sem antibióticos. Pode ser empregado, também, com sucesso na purificação de culturas contaminadas.  O tipo de recipiente testado (placas de Petri, tubos de ensaio e vidros de penicilina) não alterou a eficiência do meio, facilitando o isolamento de Armillaria e impedindo o desenvolvimento dos contaminantes. O uso de vidros de penicilina com o meio seletivo é adequado ao isolamento em condições de campo ou próximo a este, devido ao pequeno volume do vidro e de meio que é transportado.  CONCLUSÕES  Conclui-se que este meio, de fácil preparo e uso, é adequado para o isolamento, cultivo e purificação de Armillaria, pois reúne produtos de baixo custo e de fácil aquisição. Provavelmente, o meio desenvolvido poderá ser utilizado no isolamento de outros basidiomicetos, agentes de podridão de raízes ou apodrecedores de madeira.  REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  LOCKWOOD, J. L. Curso avançado sobre fitopatógenos de solo (soil borne diseases). Piracicaba, Departamento de Fitopatologia/ESALQ-USP, 1977. 41p. (datilografado).  GARRAWAY, M. O.; HÜTTERMAN, A.; WARGO, P. M. Ontogeny and physiology. In: SHAW III, C.S.; KILE, G.A. Armillaria root disease. Washington, Forest Service-USDA, Agriculture Handbook n. 691, cap. 3. p.21-47, 1991.  GOMES, N. S. B.; AUER, C. G.; GRIGOLETTI JUNIOR, A. Temperaturas para desenvolvimento de Armillaria sp. Arquivos do Instituto Biológico. v. 69, p. 278-279. 2002.  KUHLMAN, E. G.; HENDRIX, F. F. A selective medium for the isolation of Fomes annosus. Phytopathology, v.52, n.12, p. 1310-1312. 1962.  MORRISON, D. J.; WILLIANS, R. E.; WHITNEY, R. D. Infection, disease development, diagnosis, and detection. In: SHAW III, C.S.; KILE, G.A. Armillaria root disease. Washington, Forest Service-USDA, Agriculture Handbook n. 691, cap. 3. p.62-76, 1991.  TUITE, J. Plant pathological methods. Fungi and bacteria. Burgess Publishing company, Minneapolis, 1969, 239p.  3

Meio seletivo para isolamento de Armillaria sp.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/310612/1/2004RACMeioSeletivo.pdf

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