BOARI, A. de J.

CARDOSO, S. V. D.

COSTA, E. F. N. da

ISHIDA, A. K. N.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

de Iniciação Científica da EMBRAPA16 e 17 de agosto de 2012mbrapa Amazônia Oriental, Belém-PAIDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE Calonectria sp. ASSOCIADOAO MURICIZEIROSandra Valéria Dias Cardoso¹; Alessandra Keiko Nakasone Ishida²; Alessandra de Jesus Boari3;Eduardo Felipe Nunes da Costa41,4Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), 2,3Embrapa Amazônia OrientalResumo: O muricizeiro é uma importante espécie frutífera nas regiões Norte e Nordeste do Brasil. Noentanto, há poucas informações sobre as doenças que ocorrem na cultura e seus devidos danos. Assim,o presente trabalho teve como objetivo identificar um isolado fúngico associado à queima foliar deplantas de muricizeiro por meio do PCR, seguido do sequenciamento nucleotídico. O isolado fúngicofoi cultivado em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) por sete dias, sendo em seguida realizadaa extração de DNA e PCR utilizando-se os primers ITS4/ITS5. Os produtos do PCR foramsequenciados e avaliados via programas Blastn, ClustalW e Mega 5.0, onde se verificou identidade100% com acessos do gênero Calonectria.Palavras-chave: Byrsonima crassifolia, primers ITSIntroduçãoEspécies do gênero Calonectria e seu anamorfo Cylindrocladium têm uma ampla gama dehospedeiros e estão distribuídas em regiões tropicais e subtropicais associadas a sintomas que variamde queimas lesões e manchas foliares, cancros de caules, tombamento, podridão de raízes e frutos(CROUS et al., 2004; 2006; LOMBARD et al., 2009; 2010). No Estado do Pará, estas espécies foramrelatadas em cupuaçu, causando mancha parda (Calonectria kyotensis) (BENCHIMOL, 2003), emEugenia spp., Mammea americana causando lesões foliares (Cylindrocladiumcandelabrum/Calonectria scoparia, C. spathiphylli/Calonectria spathiphylli, Cylindrocladiumpteridis) (POLTRONIERI et al., 2004a; 2004b; 2011a), em mogno africano, teca e coqueiro causandomanchas foliares (Cylindrocladium parasiticum, Cylindrocladium pteridis) (TRINDADE et al., 1998;POLTRONIERI et al., 2000; 2011b) e coqueiro causando podridão peduncular em frutos(Cylindrocladium floridanum) (POLTRONIERI et al., 2003).O murucizeiro (Byrsonima crassifolia (L.) Rich.) é uma espécie frutífera da famíliaMalpighiacea, e apresenta ampla distribuição geográfica no território brasileiro, ocorrendoespontaneamente, com maior freqüência e abundância, nas regiões Norte, Nordeste e Centro-Oestede Iniciação Científica da EMBRAPA16 e 17 de agosto de 2012mbrapa Amazônia Oriental, Belém-PA(CARVALHO & NASCIMENTO, 2008). No entanto, existem poucas informações sobre as doençasque ocorrem na cultura e seus danos. Assim, o presente trabalho teve como objetivo identificar umisolado fúngico associado à queima foliar de plantas de muricizeiro por meio do PCR, seguido dosequenciamento nucleotídico.Material e MétodosUtilizou-se neste trabalho um isolado fúngico obtido de plantas de muricizeiro apresentandosintomas de queima foliar, provenientes do Campo Experimental de Tomé-Açu (CETA), o qual seencontra preservado em óleo mineral no Laboratório de Fitopatologia.Para a extração do DNA, utilizou-se uma colônia do isolado fúngico cultivada em meio batata-dextrose-ágar (BDA) por sete dias. A extração de DNA foi realizada utilizando-se o protocolo deGibbs e Mackenzie (1997). As reações de PCR foram elaboradas em um volume total de 50 Lcontendo 1μL do DNA fúngico, 5μL de tampão 5X, 3μL de MgCl2, 0,5μL dos primers ITS4 e ITS5,1μL de dNTP, 0,6μL de Taq polimerase e 33 μL de água ultra pura. As condições de amplificaçãoforam: 30 ciclos de 30 seg. a 94ºC, 30 seg. a 50ºC e 30 seg. a 72ºC, seguido de 5 min.a 72ºC. Oproduto do PCR foi avaliado em gel de agarose 0,8%, corado com GelRed (Biotium) efotodocumentado. Posteriormente, fez-se a limpeza do produto do PCR utilizando o kit Wizard SV Geland PCR Clean-UP System (Promega), seguido da quantificação de DNA. Os produtos de PCR daregião ITS foram sequenciados pela empresa HelixxaBase for Life. As sequências foram avaliadasutilizando os programas Blastn, ClustalW e Mega 5.0.Resultados e DiscussãoForam amplificados fragmentos de DNA de cerca de 450 pb na região ITS, a partir doisolado fúngico obtido do muricizeiro. O isolado associado à queima foliar, apresentou identidade100% com acessos do gênero Calonectria disponíveis no GenBank. No Estado do Pará, este gênero foirelatado causando lesões e manchas foliares em Eugenia stipitata, Eugenia patrisii, Eugeniabrachypoda, Mammea americana, Tectona grandis, Cocos nucifera e Khayai vorensis (TRINDADE etal., 1998; POLTRONIERI et al., 2000; 2004a; 2004b; 2011a; 2011 b).Apesar da região ITS ser amplamente empregada para identificação molecular de fungos,sugere-se o sequenciamento de outros genes para a identificação da espécie. O isolado de Calonectriasp.se encontra preservado em óleo mineral no Laboratório de Fitopatologia de Embrapa AmazôniaOriental para posterior caracterização morfológica e sequenciamento de outros genes indicados para ode Iniciação Científica da EMBRAPA16 e 17 de agosto de 2012mbrapa Amazônia Oriental, Belém-PAgênero Calonectria. A etiologia da doença é um passo essencial para estudos epidemiológicos, bemcomo para o estudo de estratégias de manejo efetivas para cada patógeno (MARQUES et al., 2013).ConclusãoO sequenciamento da região ITS permitiu a identificação do gênero Calonectria associado àqueima foliar do muricizeiro. Para a identificação da espécie, será realizado o sequenciamento deoutros genes indicados para o gênero Calonectria.AgradecimentosÀ Embrapa pelo financiamento do projeto de pesquisa “Melhoramento genético do bacurizeiro,camucamuzeiro, muricizeiro e cajazeira do Norte” (02.11.02.001.00.00).Referências BibliográficasBENCHIMOL, R. L. Principais doenças do cupuaçuzeiro e recomendações de controle. 2003.CARVALHO, J.E.U.; NASCIMENTO, W.M.O. Caracterização dos pirênios e métodos para acelerar agerminação de sementes de muruci do clone Açu. 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Studies inMycology, v.55, p.213-226, 2006.de Iniciação Científica da EMBRAPA16 e 17 de agosto de 2012mbrapa Amazônia Oriental, Belém-PAMARQUES, M.W.; LIMA, N.B.; MORAIS JUNIOR, M.A.; BARBOSA, M.A.G.; SOUZA, B.O.;MICHEREFF, S.J.; PHILLIPS, A.J.L.; CÂMARA, M.P.S. Species of Lasiodiplodia associated withmango in Brazil. Fungal Diversity, v.61, p.181–193, 2013.POLTRONIERI, L.S.; ALFENAS, A.C.; TRINDADE, D.R.; ALBUQUERQUE, F.C.; BENCHIMOL,R.L. A new disease of the african mahogany caused by Cylindrocladium parasiticum in Brazil.Fitopatologia Brasileira, v. 25, n.2, p. 204, 2000.POLTRONIERI, L.S.; ALFENAS, A.C.; ZAUZA, E.A.V.; TRINDADE, D.R.; POLTRONIERI, M.C.Cylindrocladium pteridis leaf spot of apricot tree in the state of Para, Brazil. Fitopatologia Brasileira,v.29, p.104-104, 2004a.POLTRONIERI, L.S.; ALFENAS, R.F.; ALFENAS, A.C.; VERZIGNASSI, J.R.; BENCHIMOL,R.L.; POLTRONIERI, T.P.S. Primeiro registro de Cylindrocladium parasiticum em plantas de teca noPará. 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Identificação molecular de Calonectria sp. associado ao muricizeiro.

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