BRIGIDA, A. I. S.

GOTTSCHALK, L. M. F.

OLIVEIRA, E. M. M.

PENHA, E. M.

SILVA, J. P. L.

SOUZA, E. F.

TERZI, S. C.

VIANA, L. A. N.

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       VII Workshop de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio             Embrapa Instrumentação, São Carlos, 10 a 13 de junho de 2013 INTERAÇÃO ENTRE FONTE DE NITROGÊNIO ORGÂNICA E INORGÂNICA NA PRODUÇÃO DE CELULOSE BACTERIANA PELA CEPA Gluconacetobacter hansenii ATCC 1431   L.M.F. GOTTSCHALK, A.I.S. BRÍGIDA, E.M. PENHA, J.P.L. SILVA, E.F. SOUZA, S.C. TERZI, L.A.N. VIANA,  E.M.M. OLIVEIRA   Embrapa Agroindústria de Alimentos, 23020-470, Rio de Janeiro, Brasil, leda.fortes@embrapa.br  Projeto Componente: 04 Plano de Ação: 02 Resumo  O presente trabalho avaliou a interação entre duas fontes de nitrogênio (uma orgânica e outra inorgânica) na produção de celulose bacteriana (CB) pela cepa Gluconacetobacter hansenii ATCC 1431. Para tanto, delineou-se um planejamento experimental 22 com pontos central e axial, onde extrato de levedura e sulfato de amônio foram adicionados ao meio sintético em diferentes concentrações, contendo glicose fixa a 20 g/L. Os experimentos foram conduzidos por 7 dias em fermentação estática a 28°C. Os resultados obtidos mostraram que maior produção de CB foi obtida sem sulfato de amônio e concentração de extrato de levedura maior que 12,5 g/L (0,856 g/L).  Palavras-chave: Celulose, gluconacetobacter, fonte de nitrogênio, planejamento experimental  Publicação relacionada L.M.F. GOTTSCHALK, A.I.S. BRÍGIDA, E.M. PENHA, J.P.L. SILVA, E.F. SOUZA, S.C. TERZI, L.A.N. VIANA E E.M.M. OLIVEIRA. Avaliação da fonte de nitrogênio na produção de celulose bacteriana pela cepa Gluconacetobacter hansenii ATCC 1431 em meio sintético. SINAFERM 2013.  Introdução Entre as muitas espécies de bactérias capazes de produzir a celulose bacteriana (CB), as do gênero Gluconacetobacter têm sido utilizadas como modelo para elucidação das características básicas da biossíntese de celulose (BASAVARAJ, HUNGUND e GUPTA, 2010). Suas propriedades únicas, tais como pureza e cristalinidade elevadas, biodegradabilidade e afinidade biológica excelentes, além da grande capacidade de retenção da água fazem da CB um novo material disponível para as indústrias de alimentos e de produtos químicos (SHODA e SUGANO, 2005).         A espécie G. hansenii, identificada como uma espécie estritamente aeróbica, gram-negativa, tem sido considerada um organismo modelo para o estudo da síntese de celulose (LYER et al., 2010).  Dependendo da forma do processo (estático ou agitado), existe uma variação nas propriedades da celulose obtida (GALAS et al., 1999). Nas condições de cultura estacionária, uma membrana espessa e gelatinosa de CB é acumulada na superfície de um meio de cultura, ao passo que em condições de cultura agitada, a celulose pode ser produzida na forma de uma suspensão fibrosa, pellets ou esferas (KRYSTYNOWICZ et al., 2002; BAE e SHODA, 2005).  Devido à limitação de rendimento na exploração comercial da CB, muitos pesquisadores vêm tentando aumentar a produtividade usando diferentes fontes de carbono 318       VII Workshop de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio             Embrapa Instrumentação, São Carlos, 10 a 13 de junho de 2013 e de nitrogênio (BASAVARAJ, HUNGUND e GUPTA, 2010; Carreira et al., 2011; MOHITE, KAMALJA e PATIL, 2012). Desde a descoberta da produção da celulose bacteriana, o meio sintético mais utilizado, meio HS (HESTRIN e SCHRAMM, 1954), possui glicose como fonte de carbono e extrato de levedura e peptona como fontes de nitrogênio O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência da concentração do extrato de levedura e do sulfato de amônio na produção da celulose pela cepa G. hansenii ATCC1431 em meio sintético.  Materiais e métodos Produção da celulose A cepa G. hansenii ATCC 1431, foi mantida em ágar manitol sob refrigeração. O pré-inóculo foi preparado com caldo manitol e incubado a 28oC por 48-72 horas. O inóculo de 5% (v/v) da suspensão de células de G. hansenii foi adicionado ao meio sintético HS (20 g/L de glicose, 1,15 g/L de ácido cítrico e 2,7 de fosfato de sódio) com as diferentes fontes de nitrogênio separadas ou combinadas (extrato de levedura e sulfato de amônio) de acordo com o planejamento experimental delineado. A fermentação foi realizada em Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio, com pH inicial ajustado em 6,0, a 28oC por 7 dias. Purificação da celulose bacteriana  As películas obtidas na superfície dos meios de cultivos foram purificadas por imersão com solução aquosa de SDS a 2% por 2 horas (em 3 lavagens) para remoção dos restos de célula bacteriana. Em seguida, aquecidas numa solução aquosa de NaOH 1M a 80°C por 30min, e então lavadas com água deionizada várias vezes para remoção do álcali residual e secas em estufa a 65°C-70°C até peso constante.   Resultados e discussão Resultados preliminares demonstraram que o sulfato de amônio em combinação com o extrato de levedura resultou num rendimento do produto (CB) por substrato consumido do meio (açúcar redutor) superior ao obtido com o meio sintético HS. Visando estudar a interação de fonte de nitrogênio orgânica e inorgânica na produção de celulose bacteriana, bem como as melhores concentrações de aplicação, aplicou-se a metodologia de superfície de resposta (MSR) através de um planejamento fatorial 22 com 3 pontos centrais e 4 axiais. A produção de celulose bacteriana, em g/L, foi definida como variável resposta. Os dados da matriz do delineamento bem como as respostas correlacionadas a cada ponto encontram-se na Tab 1.Empregou-se a técnica da Análise de Variância (ANOVA) na análise dos resultados a fim de se determinar qual o modelo seria utilizado de forma a obter o melhor ajuste aos dados experimentais para a variável resposta. A produção de celulose variou de 0 a 0,858 g/L, nas condições estudadas para os 11 experimentos.  Tab 1 – Planejamento fatorial 22 avaliando efeito da fonte de nitrogênio em diferentes concentrações na produção de celulose bacteriana (CB). Ensaio  Extrato de Levedo (%, m/v)  Sulfato de Amônio (%, m/v) Produção de CB (g/L) 1 3,6 0,7 0,432 2 21,4 4,3 0,442 3 3,6 4,3 0,312 4 21,4 0,7 0,858 5 0 2,5 0 6 25 2,5 0,624 7 12,5 0 0,856 8 12,5 10 0,540 9 12,5 2,5 0,582 10 12,5 2,5 0,639 11 12,5 2,5 0,525 A diferença entre estes pontos de mínimo e máximo foi maior do que a variação da produção de celulose para as condições de ponto central (∆ = 0,057). Assim, pôde-se observar, com confiança de 95%, efeito significativo tanto para concentração de sulfato de amônio quanto para de extrato de levedo (Fig 1).  319       VII Workshop de Nanotecnologia Aplicada ao Agronegócio             Embrapa Instrumentação, São Carlos, 10 a 13 de junho de 2013  Fig 1 – Estimativa dos efeitos lineares e quadráticos das variáveis independentes concentrações de sulfato de amônio e de extrato de levedo na produção de celulose bacteriana.   Com base nos resultados, espera-se um aumento na produção de CB com o incremento de extrato de levedura no meio. Já o sulfato de amônio, mesmo quando associado com extrato de levedura, apresentou efeito negativo na produção de celulose bacteriana. O efeito da interação das duas fontes de nitrogênio não foi  estatisticamente significativo. Assim, o modelo de segunda ordem não-linear para a produção de celulose com as variáveis codificadas incluindo apenas os parâmetros estatisticamente significativos (p < 0,05) é expresso por:  Y1 = 0,189 + 0,074X1 – 0,002X12 – 0,068X2 + 0,010X22, onde X1 é a concentração de extrato de levedo e X2 é a concentração de sulfato de amônio.  Analisando a ANOVA deste modelo, observou-se que o erro puro do modelo é pequeno, o que indica boa representatividade do mesmo (R2 = 0,96). Isto pode ser visualizado pela proximidade dos pontos reais da superfície de resposta teórica (Fig 2).  Fig 2 – Superfície de resposta para o modelo gerado para a produção de celulose bacteriana.    Conclusões A produção de celulose bacteriana pode ser incrementada quando a fonte de nitrogênio é ausente de sulfato de amônio e com concentração de extrato de levedura maior ou igual a 12,5 g/L (0,856 g/L), não sendo observado aumento significativo na produção para concentrações maiores que 12,5 g/L. Agradecimentos Os autores agradecem ao CNPq, Finep, Capes e Projeto MP1 Rede Agronano – Embrapa.   Referências BAE, S.; SHODA, M. Production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum BPR 2001 using molasses medium in a jar fermentor. Appl Microbiol Biotechnol, v. 67, p. 45-51, 2005. BASAVARAJ, S.; HUNGUND, S.; GUPTA, G. Improved production of bacterial cellulose from Gluconacetobacter persimmonis GH-2. J. Microbial Biochem. Technol., v. 2, n. 5, p. 127-133, 2010. CARREIRA, P.; MENDES, J.A.S.; TROVATTI, E.; SERAFIM, L.S.; FREIRE, C.S.R.; SILVESTRE, A.J.D.; NETO, C.P. Utilization of residues from agro-forest industries in the production of high value bacterial cellulose. Bioresource Technology, v. 102, p. 7354–7360, 2011. GALAS, E.; KRYSTYNOWICZ, A.; TARABASZ-SZYMANSKA, L.; PANKIEWICZ, T.; RZYSKA, M. Optimization of the production of bacterial cellulose using multivariable linear regression analysis. Acta Biotechnol, v. 19, p. 251-260, 1999. KRYSTYNOWICZ, A.; CZAJA, W.; WIKTOROWSKA-JEZIERSKA, A.; M GONC ALVES-MIS ´KIEWICZ, M TURKIEWICZ AND S BIELECKI. Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., v. 29, p. 189-195, 2002. LYER, P.R.; GEIB, S.M.; CATCHMARK, J.; KAO, T.; TIEN, M. Genome sequence of a cellulose-producing bacterium, Gluconacetobacter hansenii ATCC 23769. J. of Bacteriol., v. 192(16), p. 4256-4257, 2010. MOHITE, B.V.; KAMALJA, K.K.; PATIL, S.V. Statistical optimization of culture conditions for enhanced bacterial cellulose production by Gluconoacetobacter hansenii NCIM 2529. Cellulose, v. 19, p. 1655–1666, 2012. SHODA, M.; SUGANO, Y.  Recent advances in bacterial cellulose production. Biotechnol Bioprocess Eng, v. 10, p. 1-8, 2005     320

Interação entre fonte de nitrogênio orgânica e inorgânica na produção de celulose bacteriana pela cepa Gluconacetobacter hansenii ATCC 1431.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/964778/1/2013054.pdf

Interação entre fonte de nitrogênio orgânica e inorgânica na produção de celulose bacteriana pela cepa Gluconacetobacter hansenii ATCC 1431.

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