BORTOTI, G.

CARMO, K. B do

CATTELAN, A. J.

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94 	 Embrapa Soja. Documentos, 268 Teste de Elisa para a determinação da ocupação nodular Giovana Bortoti 1 ; Kelien Banhos do Carmo 1 ; Alexandre José Cattelan 2 . 1AIu-na da UNIFIL; 2 Embrapa Soja. Introdução ELISA (Enzyme Linked IrnrnunoscrbentAssay) é um teste sorológico que visa identificar e quantificar o antigeno reconhecido pelo antissoro (imunoglobulina) que lhe deu origem, formando o complexo anticorpo-antígeno, associado às propriedades colorimétricas. A coloração do meio ocorre devido à ação de certa enzima sobre um substrato cromogénico. A enzima é previamente conjugada à imuno-globulina. Atualmente, existem várias formas de se aplicar o ELISA (Clark e Bar-Joseph,1984). Várias enzimas são citadas para a obtenção de con-jugados. A sensibilidade do método de ELISA pode ser aumentada pelo uso de substratos fluorogênicos, como o fosfato 4-metil-umbeliferil. Substratos radioativos também podem ser utilizados, no entanto exigem equipamentos mais sofisticados e maior atenção. No laboratório de microbiologia do solo da Embrapa Soja o teste de Elisa é utilizado para identificar espécies Bradyrhizobiurn spp. Objetivo Verificar através do teste de Elisa quais estirpes de Bradyrliizobiurn spp, bactérias fixadoras de nitrogênio, estão presentes em nódulos de plantas de soja submetidas a diferentes tratamentos. Material e métodos Produção de antissoro Jornada académ/ca da Embrapa Soja 	 95 O antigeno foi produzido a partir das estirpes de Bradyrhizobium SEMIA 587, 5019, 5079 e 5080. Crescidos em meio sólido; suspensos em imi de solução salina e centrifugados (1000 rpm, 10 mm). Descartou-se sobrena-dante, adicionou 1 ml de sol. salina, repetiu-se novamente e na 3a  vez adicionou-se 0,5 ml de sol. salina e agitou. Aqueceu-se em banho-maria a 100°C por 15 mm. Completou para 1 ml com solução tampão de cobertu-ra. Manteve em geladeira (4°C, usar em questão de dias). Com o antígeno pronto, fez-se a imunização do animal a fim de produzir o antissoro. O ani-mal escolhido foi o coelho, pois, eles permitem retirar quantidades sufici-entes de sangue, além de serem de fácil manuseio. O esquema de imuni-zação usado é de injeções intramusculares. Após a injeção do antigeno, ocorrem diferentes reações no sistema imunológico do animal, incluindo a produção de anticorpos. A imunização segue o cronograma descrito abaixo. O animal chega no biotério e fica três dias em observação para se verifi-car sua saúde. O inicio da imunização deve ocorrer numa sexta-feira, onde se aplica o antigeno + adjuvante completo. Nos dias em que não há aplicação deve-se sempre verificar a situação do coelho. A próxima apli-cação será na quarta-feira seguinte onde se aplica antigeno + adjuvante incompleto. Após quatro dias, uma nova aplicação de antígeno + adjuvante incompleto. Três dias após, aplica-se antigeno + adjuvante incompleto, espera-se mais quatro dias e aplica-se pela última vez antígeno + adjuvante incompleto. Cinco dias depois, no período da tarde, retira-se a ração para que no dia seguinte pela manhã se faça a sangria. Existem dois métodos de sangria: a punção Cardíaca e pela orelha. Na punção Cardíaca é feita somente uma coleta de sangue, retirada diretamente do coração por uma seringa esterilizada. Em seguida, aplica-se loa 15 ml de éter no mesmo local, causando a morte instantânea. A sangria pela orelha ocorre na veia marginal da orelha. Usa-se xilol para dilatar a veia, fazendo-se o corte com lâmina de barbear. O método mais indicado é ode punção cardíaca, pois além de causar menos sofrimento para o animal, a quantidade de soro obtido é maior. Quando o período de imunização e coleta chegam ao fim é necessária a limpeza do biotério. A amostra de sangue coletada terá como fim, a reali-zação dos testes de título e reação cruzada. 96 	 Embrapa So/a. Documentos, 268 O teste do título dos antissoros têm como o objetivo determinar se a con-centração de anticorpos do soro está alta ou baixa. Tem-se como início a diluição deste antissoro começando em 11100 até 1151200. O diluente usado é PBS-Tween. Primeiro pipetar 10 ul de antissoro em um tubo com 990 ul de PBS-Tween (11100), retiram-se 500 ul deste tubo e distribuem-se nos outros tubos até obter a última diluição (para isso repete-se 10 vezes). O titulo é determinado através da preparação de uma placa de Elisa, tendo as bactérias presentes juntamente com as diluições dos antissoros, seguindo-se a metodologia descrita por Fuhrmann & Wollum (1985). Repousar por uma noite e no dia seguinte fazer a leitura do título no espectrofotõmetro. Após a determinação do título, escolher as dilui-ções para utilizar no teste de reação cruzada. Este teste tem o objetivo de verificar se há possibilidade de uma bactéria reagir com o antissoro de outra. A placa é montada com as diluições escolhidas. Depois da monta-gem da placa, incubar em geladeira à 4°C por uma noite. No dia seguinte, lavar uma vez, adicionar 100 ul de tampão substrato com o reagente Phosphatase Substrate, deixar repousar à temperatura ambiente de 30 a 50 mm. e observar a reação colorimétrica do antissoro com o seu especí-fico antigeno. Fazer leitura em leitor para placas de Elisa. Se os teste de titulo e de reação cruzada tiverem resultado positivo, terá então o inicio dos testes nodulares. O antigeno nodular é preparado da seguinte forma: - esmagar os nódulos em tubos plásticos com 0,5 ml de salina (flambar as pinças entre os nódulos); -Aquecer em banho-maria a 1001C por 15 mm.; - completar para 1 ml com tampão de cobertura. Após a preparação dos antigenos começa uma seqüência de procedimentos para realização do Elisa: 1a  Etapa - Incubação de cobertura (período da tarde), pipetar 100 ul de antigeno por compartimento da placa (pipetar para um número de compartimento igual ao número de antissoros sendo testados), incubar à temperatura ambiente por 1 hora, esvaziar a placa e secar, lavar com PBS-Tween por 4 vezes, secando bem entre as lavadas. 21 Etapa - pipetar 100 ul de antissoro com o titulo corrigido por comparti-mento, a diluição do antissoro se dará com PBS-Tween, cobrir as placas e incubá-las a 28°C por 1 hora e, em seguida, lavar como anteriormente. 31 Etapa - adicionar 100 ul do conjugado diluído 5000x em PBS-Tween, incubar em geladeira 4°C durante a noite, lavar como em 1. 4a  Etapa - Jornada académica da Em/rapa Soja 	 97 adicionar 100 ul de solução fresca de substrato contendo 1 mg de substrato por ml de tampão para substrato, incubar a temperatura ambiente por 30 a 50 mm. ou até a cor amarela das reações positivas aparecer, fazer a leitura em leitor para placas de Elisa, absorbância de 405 nm, caso a leitura não possa ser feita imediatamente, adicionar 3 gotas de NaOH 3M por compartimento. Resultados Têm-se através do teste de Elisa a determinação da ocupação nodular das estirpes de Bradyrhizobium spp. presentes em plantas de soja, o qual sua função é proporcionar urna maior fixação biológica de nitrogênio no solo. Após identificação nodular, outros trabalhos serão elaborados afim de garantir a total eficiência das estirpes para a plantação de soja. Referências Bibliográficas CLARK, ME; BAR-JOSEPH, M. Methods in virology. NewYork:Academic Pess, 1984. P51-85 FUHRMANN, J.J.; WOLLUM II, A.G. Simplified enzyme-linked immunosorbent for routine identification of Rhizobium japonicum antigens. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v.49, p1010-1013, 1985. 

Teste de Elisa para a determinação da ocupação nodular.

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