DINIZ, L. E. C.

FERREIRA, J. M. S.

OLIVEIRA, F. A. de

SANTOS, A. L.

SANTOS, M. S. dos

TALAMINI, V.

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54 II Seminário de Iniciação Científica e Pós-graduação da Embrapa Tabuleiros CosteirosMagali Santana dos Santos1, Leandro Eugenio Cardamone Diniz2, Joana Maria dos Santos Ferreira3, André Luiz Pinto Santos4, Frederico Alberto de Oliveira5, Viviane Talamini6ResumoForam analisados quinze isolados de Thielaviopsis paradoxa, obtidos de amostras coletadas de solo, do inseto Rhynchophorus palmarum e de palmeiras, dentre elas o coqueiro, as quais foram analisadas quanto a variabilidade genética por meio de marcadores moleculares RAPD. Analisando a similaridade genética foi possível a formação de quatro grupos com coeficientes variando de 70 a 91 %. O primeiro grupo formado pelos isolados obtidos da palmeira Imperial e da palmeira Azul. O segundo grupo foi formado pelos isolados de Neópolis, SE, sendo dois provenientes do inseto R. palmarum e dois isolados do coqueiro. O terceiro grupo, formado por dois isolados, um de R. palmarum e outro do coqueiro são de áreas relativamente distantes (São Cristóvão, SE, e Piaçabuçu, AL). O quarto grupo contou com os isolados obtidos do solo. Dois isolados foram altamente divergentes dos demais, havendo a necessidade de verificação da etiologia destes espécimes.Palavras-chave: resinose, marcadores moleculares, polimorfismo, palmeiras.1 Estudante de Biologia, Bolsista CNPq/Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE, magalisolivei-ra@yahoo.com.br.2 Biólogo, Doutor em Genética e Melhoramento, Pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE, leandro.diniz@embrapa.br.3 Engenheira Agrônoma, Mestre em Entomologia, Pesquisadora da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE, joana.ferreira@embrapa.br.4 Estudante de Biologia, Bolsista FAPITEC/Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE, andre-luiz_04@yahoo.com.br.5 Engenheiro-agrônomo, Doutor em Fitopatologia, DCR FAPITEC/CNPq/Embrapa Tabuleiros Costeiros Aracaju, SE, fredericoalberto@yahoo.com.br.6 Engenheira-agrônoma, Doutora em Fitopatologia, Pesquisadora da Embrapa Tabuleiros Costei-ros, Aracaju, SE, viviane.talamini@embrapa.br.Caracterização da Variabilidade Genética da Coleção de Isolados de Thielaviopsis paradoxa55II Seminário de Iniciação Científica e Pós-graduação da Embrapa Tabuleiros CosteirosIntroduçãoA doença denominada “stem bleeding” é conhecida nas áreas produtoras de palmeiras no mundo, incluindo o coqueiro (Cocos nucifera L.), sendo causada pelo fungo Thielaviopsis paradoxa (De Seyn) Hölh, anamorfo do ascomiceto Ceratocystis paradoxa (Dade) C. Este fungo também foi detectado associado a doenças em diversas espécies de plantas tropicais como abacaxi, cana-de-açúcar e bananeira. T. paradoxa já foi isolado a partir do solo e de insetos como o Rhynchophorus palmarum (PARRA et al., 2003). Nas áreas produtoras de coco no Brasil esta doença foi registrada em 2004 e denominada resinose (WARWICK; PASSOS, 2009). Nesta cultura, o fungo também foi associado a queda prematura dos frutos jovens (CARVALHO et al., 2012). Mesmo diante da relevância desta doença, praticamente não foram encontrados estudos sobre a variabilidade genética deste fungo com a utilização de marcadores moleculares. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar por meio de marcadores do tipo RAPD, a diversidade genética de isolados de T. paradoxa provenientes dos Estados de Sergipe, Bahia e Alagoas.Material e MétodosAs atividades deste trabalho foram desenvolvidas no Laboratório de Controle Biológico e no Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Tabuleiros Costeiros Para esta análise foram selecionados 15 isolados (Tabela 1), coletados nos Estados de Sergipe, Bahia e Alagoas, pertencentes à coleção de isolados de T. paradoxa da Embrapa Tabuleiros Costeiros. Os isolados foram repicados individualmente para frascos com meio batata e dextrose, com agitação a 100 RPM, por 4 dias, quando a massa micelial foi coletada e submetida a filtração a vácuo sendo congelado em seguida. Para a extração do DNA, dois gramas do micélio foram macerados em nitrogênio líquido e submetido a extração utilizando protocolo estabelecido pelo Kit de Extração de DNA de Plantas e Fungos da Norgen Biotek®. Para a quantificação do DNA foi utilizado um espectrofotômetro NanoDrop 2000c (Thermo®).56 II Seminário de Iniciação Científica e Pós-graduação da Embrapa Tabuleiros CosteirosUma vez quantificadas as amostras, as mesmas foram submetidas a amplificação por PCR utilizando 15 primers de RAPD. As amplificações foram realizadas em termociclador Axygen®. O produto destas reações foi separado por eletroforese em gel de agarose e coloração em brometo de etídeo e fotodocumentados em L-Pix HE (Loccus®). A análise da similaridade genética foi feita utilizando o software POP2. O perfil eletroforético de cada primer de RAPD foi transformado em uma matriz binária, empregada na estimativa das estatísticas subsequentes.Resultados e DiscussãoPor meio do dendrograma de dissimilaridade verificaram-se quatro grupos. O primeiro grupo apresentou similaridade genética de 70% e foi formado pelos isolados TC041 e TC036 coletados de palmeira Imperial e palmeira Azul de Alagoas e Sergipe, respectivamente. Tabela 1. Isolados de Thielaviopsis paradoxa coletados nos em Sergipe, Alagoas e Bahia.TC 003 Coqueiro (estipe) Neópolis-SETC 004 Coqueiro (estipe) Neópolis-SETC 005 Rhynchophorus palmarum Neópolis-SETC 006 Rhynchophorus palmarum São Cristovão-SETC 012 Rhynchophorus palmarum Neópolis-SETC 013 Rhynchophorus palmarum São Cristovão-SETC 023 Coqueiro (estipe) Piaçabuçu-ALTC 027 Coqueiro (estipe) Neópolis-SETC 034 Coqueiro (estipe) Conde, BATC 036 Palmeira Azul (raiz) São Cristovão-SETC 040 Solo São Cristovão-SETC 041 Palmeira Imperial (raiz) Boca da Mata, ALTC 042 Planta Ornamental (raiz) São Cristovão-SETC 045 Solo Aracaju-SETC 046 Solo Aracaju-SE57II Seminário de Iniciação Científica e Pós-graduação da Embrapa Tabuleiros CosteirosO segundo grupo foi formado pelos isolados TC012, TC004, TC005 e TC027, todos coletados em Sergipe na região de Neópolis. A similaridade genética entre estes isolados foi muito grande, variando entre 75% (isolados TC005 e TC027) e 91% (isolados TC004, TC005 e TC012) o que pode indicar que o inseto R. palmarum carrega propágulos (TC005) do fungo possíveis de causar doenças nas plantas. Um terceiro grupo, formado por apenas dois isolados (TC013 e TC023) apresentou uma similaridade genética muito alta, em torno de 86%. Estes isolados são de áreas relativamente distantes, sendo a primeira coletada em insetos encontrados de São Cristóvão, SE, e a segunda no estipe de coqueiro na cidade de Piaçabuçu, AL. Um quarto grupo foi formado pelos isolados TC040, TC045 e TC046, todos estes coletados diretamente do solo de regiões infectadas e com similaridade genética variando entre 74 e 86%. O fungo isolado do solo de São Cristóvão apresentou similaridade alta com quase todos os isolados obtidos no Estado de Sergipe (entre 70 e 81%). O isolado TC006 coletado em São Cristovão apresentou boa similaridade genética com os isolados TC013 e TC040 também da mesma região (cerca de 73%). Já os isolados TC003 e TC042, coletados em Neópolis e São Cristovão, respectivamente, apresentaram alta dissimilaridade genética com todas as outras amostras, o que pode indicar isolados oriundos de regiões muito distantes, ou ainda que estejam indevidamente classificados com T. paradoxa. Até o presente, poucos trabalhos com relação a variabilidade genética de T. paradoxa foram encontrados utilizando T. paradoxa. Costa Neto (2002) identificou este fungo em pupunha (Bactris gasipaes) e o compara aos demais Figura 1. Dendrograma de dissimilaridade genética entre as 15 amostras avaliadas.58 II Seminário de Iniciação Científica e Pós-graduação da Embrapa Tabuleiros Costeirosfungos endofíticos encontrados nesta planta, tendo encontrado após analise das regiões espaçadoras ITS 1 e 2 e do gene 5,8S pouca variabilidade genética.ConclusõesA partir dos resultados obtidos, conclui-se que há o indicativo de uma grande diversidade genética entre os isolados estudados e que um estudo ampliado com mais isolados, mais primers (RAPD e específicos) e ainda o sequenciamento de regiões conhecidas, como ITS 1 e ITS2 bem como o gene 5,8S seria muito importante para uma melhor classificação dos isolados e análise de similaridade genética. ReferênciasCARVALHO, P.A.; MORAES, W.S.; CARNEIRO, O.L.G.; PEREIRA, T.G.; LIMA, J.D. Ceratocystis paradoxa ocorrendo em palmeiras frutíferas e ornamentais do Vale do Ribeira. Disponível em <http://prope.unesp.br/xxi_cic/27_36950928823.pdf>, 2012. Acessado dia 20 de julho de 2012.COSTA NETO, P.Q. Isolamento e identificação de fungos endofíticos da pupunha (Bactris gasipaes Kunth) e caracterização por marcadores moleculares. São Carlos: UFSCar, 2002, 86p.PARRA, D.; MORILLO, F.; SÁNCHEZ, P.; PINEDA, J.; GUERRA, J. Presencia de Thielaviopsis paradoxa De Seynes Höhn en el tubo digestivo de Rhynchophorus palmarum Linneo (Coleoptera: Curculionidae). Entomotropica, v.18, p. 49-55, 2003.WARWICK, D.R.N.; PASSOS, E.E.M. Outbreak of stem bleeding in coconuts caused by Thielaviopsis paradoxa in Sergipe, Brazil. Tropical Plant Pathology, v. 32, p 175-177, 2009.

Caracterização da variabilidade genética da coleção de isolados de Thielaviopsis paradoxa.

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