BRAZ FILHO, R.

CUNHA, C. P.

FELBERG, I.

FERREIRA, J. N.

GODOY, R. L. O.

OLIVEIRA, D. R.

PACHECO, S.

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 1  AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DAS ISOFLAVONAS EM EXTRATO DE SOJA   EVALUATION OF THE STABILITY OF ISOFLAVONES IN SOYMILK  CUNHA, C.P.1; FELBERG, I.2; GODOY, R.L.O.2; PEREIRA, J.N.3; OLIVEIRA, D.R.2; PACHECO, S.2; BRAZ FILHO, R.4.  1Bolsista de pós-graduação CAPES programa PPGQ, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ; e-mail: carolpassos_c@hotmail.com 2Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ;  3Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ. 4Pesquisador Emérito –FAPERJ/UENF/UFRRJ;   Resumo A soja e seus produtos vêm sendo amplamente estudados devido ao seu alto valor nutricional e presença de compostos bioativos, como as isoflavonas. Estas podem funcionar como moduladores hormonais naturais, além de possuírem atividade antioxidante. No entanto, a estabilidade destes compostos é importante para sua função biológica e alterações nas suas estruturas químicas podem ocorrer tanto no processamento quanto no armazenamento. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a estabilidade de isoflavonas em extrato de soja congelado durante 120 dias. O extrato de soja foi submetido à análise de isoflavonas por cromatografia líquida de alta eficiência, conforme método oficial da AOAC. As análises foram realizadas com 0, 7, 15, 30, 60, 90 e 120 dias de armazenamento. As estruturas das isoflavonas foram confirmadas por ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H) e carbono-13 (RMN13C). Verificou-se que até 120 dias não houve variação no teor de isoflavonas totais e individuais em agliconas no produto armazenado.  Introdução O consumo de soja vem crescendo mundialmente, o Brasil é o segundo maior produtor mundial, ficando apenas atrás dos Estados Unidos, na safra 2009/2010 produziu 68,7 milhões de toneladas (EMBRAPA, 2011). A soja (Glycine Max L. Merrill) é uma leguminosa considerada um alimento funcional, além de ser um alimento rico em proteína e possuir outros componentes benéficos à saúde humana. Seu consumo está associado à redução de risco de várias doenças, como câncer de mama, próstata e outras formas de câncer hormônio dependentes, osteoporose e doenças cardíacas (MESSINA et al. 2009). Dentre os vários componentes da soja, as isoflavonas têm recebido atenção especial, pois além de possuir atividade antioxidante (LIANG et al., 2010, BARBOSA et al. 2011) podem funcionar como moduladores hormonais naturais (LIU et al., 2010, SANCHES et al. 2010) por possuírem similaridades funcionais ao estrogênio humano 17-β-estradiol (GENOVESE & LAJOLO, 2002; MESSINA et al., 2006). Ambos possuem uma hidroxila ligada ao anel aromático e outra hidroxila a uma distância idêntica da primeira (WUTTKE et al., 2007).  Extrato de soja é o produto obtido a partir da emulsão aquosa resultante da hidratação dos grãos de soja, convenientemente limpos, seguido de processamento tecnológico adequado, adicionado ou não de ingredientes opcionais permitidos, podendo ser submetido à desidratação, total ou parcial (BRASIL, 1978), sendo que o extrato líquido deve apresentar no mínimo 3% de proteína e o extrato em pó no mínimo 40% (BRASIL, 2005). É importante levar em consideração que a composição química do extrato de soja, incluindo os teores de isoflavonas, varia de acordo com a matéria-prima e o processamento dos grãos (CIABOTTI et al., 2006). Tendo demonstrado a importância das isoflavonas em soja e em produtos derivados, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a estabilidade de isoflavonas em extrato de soja líquido congelado a -18°C durante 120 dias.   2  Material e Métodos Extração de isoflavonas A extração e quantificação das isoflavonas foi baseada no método da AOAC (2005). A separação cromatográfica foi realizada em coluna C18, YMC (250x4,6mm com partícula de 5µm), à 45°C, com fluxo de 1,3mL/min em modo de eluição gradiente (Tabela 1) de Fase A (metanol:ácido acético 98:2) e Fase B (água:metanol:ácido acético 88:10:2), e volume de injeção igual a 25µL. A faixa de comprimento de onda utilizada foi de 200 à 400nm, o espectro foi extraído à 260nm. O teor de isoflavonas totais foi expresso em mg de aglicona por 100g, multiplicando-se o teor do derivado glicosídico pela razão entre o peso molecular da aglicona equivalente e do derivado glicosídico (KLUMP et al, 2001).  Tabela 1. Gradiente de eluição da fase móvel Tempo Fase A Fase B ----- min ----- ----- % ----- ----- % ----- 0,00 90 10 30,00 40 60 30,05 0 100 35,00 0 100 35,05 90 10 45,00 90 10 Estudo de estabilidade O extrato de soja foi obtido por processamento dos grãos. Deste extrato, foi retirada uma alíquota para extração e análise de isoflavonas (dia 0).  O restante do extrato de soja foi divido em alíquotas que foram acondicionadas em congelador. Periodicamente, duas amostras foram retiradas do congelador e submetidas à análise em duplicata quanto ao teor de isoflavonas (Tabela 2).   Tabela 2. Periodicidade da análise Alíquota do extrato Tempo  --------------dias------------- 1 0 2 7 3 15 4 30 5 60 6 90 7 120  Espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) Todos os espectros de RMN foram adquiridos em um espectrômetro Bruker DRX-500 (operando a 499,80 e 125.69MHz para 1H e 13C, respectivamente) existente no Programa de Pós-graduação em Química da UFRRJ. Os deslocamentos químicos (δH e δC) em p.p.m foram referenciados com base nos correspondentes valores residuais do solvente  MeOD (δH 3.31 e δC 49.15) usado. As constantes de acoplamento (J) foram registradas em Hz. Os espectros heteronucleares 2D HSQC (1H-13C-COSY-1JCH) e HMBC (1H-13C-COSY-nJCH, n=2 e n=3) foram adquiridos com 8 transições/128 incrementos e 4 transições/128 incrementos, respectivamente. Para os espectros homonucleares 2D COSY-1H-1H foram usadas larguras espectrais de  5000Hz em ambas as dimensões e o número normal de transições.  Resultados e Discussão  No extrato de soja foram detectadas as isoflavonas daidzina, daidzeína, genistina e genisteína (Figura 1).   3  OOOHRO123456789101'2'3'4'5'6'1   R=H   (Daidzeina)2   R=glicopiranosil  (Daidzina)OOOHROOH123456789101'2'3'4'5'6'3 . R=H   (Genisteina)4   R=glicopiranosil  (Genistina) Figura 1. Estruturas das isoflavonas (daidzina, genistina, daidzeína e genisteína) detectadas no extrato de soja  Estas estruturas foram confirmadas definitivamente através da interpretação de dados espectrais de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H) e carbono-13 (RMN13C), envolvendo experiências uni- (1D) e bidimensionais (2D). A Tabela 3 apresenta o teor das isoflavonas individuais em equivalente em agliconas para as isoflavonas glicosídicas e isoflavonas totais.  Tabela 3. Média da concentração de cada isoflavona em equivalente em agliconas para as isoflavonas glicosídicas, isoflavonas totais (± desvio padrão) Dia Média da concentração (mg/100g) em equivalente em aglicona (± desvio padrão)  Daidzeína Gliciteína Genisteína Daidzina Glicitina Genistina Totais 0 0,28±0,01 ND 0,34±0,02 7,36±0,39 ND 10,52±0,22 18,49±0,43 7 0,25±0,02 ND 0,34±0,03 8,63±0,62 ND 11,41±0,70 20,02±2,12 15 0,26±0,01 ND 0,31±0,01 8,21±0,13 ND 11,11±0,24 19,89±0,37 30 0,24±0,01 ND 0,32±0,01 7,86±0,07 ND 10,78±0,09 19,20±0,15 60 0,28±0,05 ND 0,37±0,10 8,57±0,11 ND 11,17±0,10 20,39±0,22 90 0,27±0,03 ND 0,36±0,01 8,12±0,27 ND 10,84±0,32 19,58±0,61 120 0,25±0,01 ND 0,33±0,02 8,37±0,22 ND 10,83±0,28 19,78±0,52 ND= Não detectado  A Figura 2 sumariza o teor relativo de cada isoflavona (daidzina, genistina, daidzeína e genisteína) e isoflavonas totais por dia de ensaio.               Figura 2. Concentração de isoflavonas totais e individuais (daidzina, genistina, daidzeína e genisteína) em porcentagem relativa por dia de ensaio.  Não foi observada tendência de alteração na concentração de isoflavonas durante o período avaliado. A pequena variação observada é devido à análise ter sido realizada em dias diferentes. Portanto as isoflavonas mantiveram-se estáveis durante o período avaliado, tanto individualmente quanto o teor de isoflavonas totais.    4  Conclusão O teor de isoflavonas totais e individuais em equivalente em agliconas permaneceu estável durante o período estudado. Períodos maiores serão avaliados.  Referências AOAC. Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists; 18th ed. AOAC: Gaithersburg, Maryland, 2005. BARBOSA, A.C.; LAJOLO, F.M.; GENOVESE, M.I. Effect of free or protein-associated soy isoflavones on the antioxidant status in rats. Journal of the Science of Food and Agriculture. v. 91, p. 721–731, 2011. BRASIL. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução - ANVISA n°268/2005, de 22/09/2005. Regulamento técnico para produtos protéicos de origem vegetal. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 23 de set. 2005. BRASIL. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução - ANVISA n°14/1978, de 28/06/1978. Padrão de identidade e qualidade para farinha desengordurada de soja, proteína texturizada de soja, proteína concentrada de soja, proteína isolada de soja e extrato de soja. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 28 de jun. 1978. CIABOTTI, S.; BARCELLOS, M. F. P.; MANDARINO, J. M. G.; TARONE, A. G. Avaliações químicas e bioquímicas dos grãos, extratos e tofus de soja comum e de soja livre de lipoxigenase. Ciência agrotecnologia, Lavras, v. 30, n. 5, p. 920-929, 2006. EMBRAPA. A Soja. Disponível em: <http://www.cnpso.embrapa.br/index.php?op_page=22 &cod_pai=16>. Acesso em: 10 de dezembro de 2011. GENOVESE, M.I.; LAJOLO, F.M. 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Avaliação da estabilidade das isoflavonas em extrato de soja.

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Avaliação da estabilidade das isoflavonas em extrato de soja.

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