Este trabalho objetivou identificar marcadores microssatélites ligados a genes de resistência a Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli em feijoeiro comum

BALSALOBRE, T. W. A.

BARRETO, F. Z.

CARNEIRO, M. S.

COSTA, J. G. C. da

CRUZ, L. P. da

EVANGELISTA, D. E.

FERNANDES, L. G. V.

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MAPEAMENTO GENÉTICO DA RESISTENCIA A MURCHA DO FUSARIO EM FEIJOEIRO COMUM  Thiago Willian Almeida Balsalobre1, Danilo Elton Evangelista1, Larissa Prado da Cruz1, Luis Guilherme Virgílio Fernandes1, Fernanda Zatti Barreto1, Joaquim Geraldo Cáprio da Costa2 e Monalisa Sampaio Carneiro3 Resumo  Este trabalho objetivou identificar marcadores microssatélites ligados a genes de resistência a Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli em feijoeiro comum. Foram utilizadas duas linhagens (FT Tarumã e Macanudo) contrastantes em níveis de resistência à doença para obter a geração F2, e posteriormente famílias F2:3.  A genotipagem com os marcadores microssatélites foi realizada na geração F2, e fenotipagem para resistência em casa de vegetação nas famílias F2:3. Foi adotada a estratégia de BSA (Bulked Segregant Analysis). Um total de 167 marcadores microssatélites foram avaliados nos genitores e nos bulks resistentes e suscetíveis.  Marcadores potencialmente ligados a genes de resistência, identificados pelo método BSA, foram avaliados em cerca de 100 indivíduos segregantes para confirmar a existência de ligação. Dois marcadores, PvM 066 e PvM 127, mostraram-se significativamente associados (p<0,000266 e p<0, 0037571).   Introdução  O feijoeiro comum é a principal leguminosa utilizada na alimentação humana, apresenta grande importância econômica e social, sendo um elemento importante como fonte protéica na dieta de enorme parcela da população mundial. (FERREIRA, 2006). No Brasil, o feijão é cultivado tanto por pequenos agricultores, quanto por empresários rurais altamente tecnificados. Embora o Brasil seja o maior produtor e consumidor mundial de feijão, ainda apresenta baixa produtividade, devido, dentre outros fatores, a ocorrência de doenças, entre elas a murcha ou amarelecimento de fusário causada por F. oxysporum f. sp. phaseoli, que provoca danos econômicos consideráveis à produção (CÂNDIDA, 2008). Os sintomas da doença manifestam-se por perda de turgescência, amarelecimento, queda progressiva de folhas e escurecimento dos vasos, podendo variar consideravelmente em intensidade, dependendo da reação da cultivar, severidade de infecção e condições de ambiente (ABAWI, 1989). Pesquisas têm mostrado que este patógeno apresenta pouca variação genotípica e que a herança da resistência genética da planta é controlada por poucos genes (SALGADO; SCHWARTZ; BRICK, 1995; BALSALOBRE et al., 2008), o que facilita na obtenção de cultivares superiores pela transferência de alelos de resistência de fontes não comerciais e, muitas vezes, não adaptadas, para cultivares elite (ALZATE-MARIN et al., 2005). O estudo de caracteres quantitativos vem sendo realizado por meio de estimativas de parâmetros genéticos obtidos a partir da mensuração fenotípica, ou seja, tais estimativas representam o somatório dos efeitos dos locos segregando para o caráter. A principal alternativa para o conhecimento do número aproximado de locos atuando no controle genético dos caracteres quantitativos, de como esses locos encontram-se distribuídos no genoma e qual a intensidade dos seus efeitos, é estudá-los indiretamente, por meio da associação com marcadores genéticos (PEREIRA, 2006). O objetivo deste trabalho foi o mapeamento de genes associados à resistência à murcha de fusário em feijoeiro comum, utilizando marcadores microssatélites. 1  1. Graduação em Biotecnologia, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de São Carlos, CEP 13600-970. E-mail: thiago2pierre@hotmail.com; daniloee@hotmail.com;larissa.p.cruz@hotmail.com; luisgui530@hotmail.com; fernandazatti@hotmail.com  2. Pesquisador da Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antonio de Goiás, Goiás, CEP 75375-000. E-mail: caprio@cnpaf.embrapa.br 3. Professora Adjunto do Departamento de Biotecnologia Vegetal, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de São Carlos, CEP 13600-970. E-mail: monalisa@cca.ufscar.br Apoio financeiro: CNPq/Edital Universal/ Proc. Nº 475217/2006-3 Material e Métodos  Material vegetal  O plantio e inoculação foram conduzidos em casa de vegetação na Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antonio de Goiás, Goiás. A extração do DNA e as análises com os marcadores microssatélites foram realizadas no Laboratório de Genética Molecular da Universidade Federal de São Carlos, campus de Araras, São Paulo.  Como genitor resistente ao isolado FOP 46 foi utilizada a cultivar FT Tarumã, e como suscetível a cultivar Macanudo (RAVA; SARTORATO; COSTA, 1996)  Cruzamento controlado foi realizado entre FT Tarumã e Macanudo para obter a geração F1. Os indivíduos dessa geração foram autofecundados, originando a geração F2. Da geração F2, os indivíduos foram autofecundados produzindo 120 famílias F2:3. Uma solução contendo esporos do fungo foi utilizada para inoculação artificial em casa de vegetação das famílias de feijoeiro da geração F2:3. O delineamento experimental foi em blocos casualizados com duas repetições, sendo que cada uma foi composta por seis indivíduos F2:3. Os tratamentos foram constituídos por 120 famílias F2:3, que foram avaliadas quanto a resistência a murcha do fusário com base na escala diagramática com notas de severidade que variam de 1 (0% de tecido afetado) a 9 (75% de tecido afetado) (CÂNDIDA, 2008; BALSALOBRE et al., 2008). Com base na avaliação da resistência, para cada cruzamento foram constituídos bulks resistente e suscetível, ou seja, genótipos com notas de 1 a 3 formaram o bulk resistente e, de 7 a 9 o bulk susceptível.  Genotipagem com marcadores microssatélites   O DNA foi extraído a partir de 250 mg de folhas frescas de acordo com Hoisington, Khairallah, Gonzalez-de-Leon (1994). A quantificação das amostras de DNA foi realizada em gel de agarose 1%, comparando-as com uma série de concentrações conhecidas do DNA (20, 40, 80 e 160 ng) do fago , visualizadas através da coloração com brometo de etídio (0,5 g/ml) sob luz ultravioleta.  Os genitores e os seus respectivos bulks foram avaliados quanto ao polimorfismo para 167 locos microssatélites (destes 157 foram gênicos e 10 genômicos). Os locos que apresentaram polimorfismo foram genotipados na população F2:3. As reações de amplificação foram feitas em volume final de 15 l, contendo 15 ng de DNA molde, 0,50 unidade de Taq DNApolimerase (Fermentas), 1X tampão da Taq, 200 M de cada dNTP, 0,25 M de primer forward, 0,25 M de primer reverse, 2500 M de MgCl2 e água Milli-Q. As condições de amplificações foram estabelecidas conforme Hanai et al. (2007). As reações foram realizadas no termociclador Applied biosystems, modelo 9700 PCR System.  Após a amplificação, cada amostra recebeu 7,5 l de tampão de carregamento e em seguida foi submetida à desnaturação de 94 ºC por 5 minutos. A eletroforese dos fragmentos amplificados foi realizada em gel de poliacrilamida 6,5% em cuba vertical Sequi Gen GT da BioRad durante 2 horas e 30 minutos sob potência constante de 70 W. A visualização das bandas foi realizada em solução de nitrato de prata conforme descrito por Creste et al. (2001).  Análises Estatísticas  Análises estatísticas para verificação de ligação entre locos marcadores e genes de resistência a F. oxysporum f. sp. phaseoli, foram realizadas por meio de análise de variância, onde genótipos marcadores para cada loco marcador foram considerados variáveis independentes e a severidade da doença, variável dependente (EDWARDS; STUBER; WENDEL, 1987). Testes de regressão linear foram utilizados para estimar as magnitudes das variâncias fenotípicas para resistência explicadas pelas associações genes-marcadores (R2).  Resultados e Discussão  Dos 167 locos marcadores testados, 157 mostraram-se não informativos, ou seja, não revelaram polimorfismos entre as linhagens genitoras. Dos 10 locos informativos, sete revelaram polimorfismo entre os segregantes agrupados (PvM 037, PvM 115, PvM 127, PvM 066, PvM 118, FJ 51 e FJ 55), demonstrando potencial de estarem ligados a QRL (Quantitative Resistance Loci) a F. oxysporum f. sp. phaseoli (Fig. 1). Dos sete locos marcadores analisados, dois (PvM066 e PvM127) mostraram associação significativa (p<0,000266 e p <0,037571, respectivamente) com resistência a F. oxysporum f. sp. phaseoli. Para estes marcadores, o restante da população segregante também foi genotipada (99 indivíduos para o marcador PvM 066 e 100 indivíduos para o marcador PvM 127) e o teste de regressão linear foi aplicado para verificar a magnitude do efeito fenotípico da ligação entre marcador/QRL. A associação entre o loco marcador PvM 066 e o QRL explicou 15,61 % da variação fenotípica para resistência verificada entre as plantas F2, ao passo que a associação com PvM 127 explicou 6,54% (Tab. 1).  Na associação PvM 127/QRL a severidade média para a classe genotípica homozigota para alelos do genitor resistente foi de 5,34, enquanto que aquela homozigota para alelos do genitor suscetível foi de 6,20. Para a classe heterozigota, a média foi de 5,43, não diferindo estatisticamente da primeira classe. Assim, o alelo do genitor resistente contribuiu em 12,4 % na redução da severidade da doença quando em heterozigose no loco em questão. Para a associação PvM 066/QRL, a severidade média para a classe genotípica homozigota para alelos do genitor resistente foi de 4,52, ao passo que aquela homozigota para alelos do genitor suscetível foi de 5,20, o que representa uma redução de 13 % na severidade da doença quando em heterozigose no loco em questão.  Neste trabalho, foi identificada uma região genômica associada à resistência à F. oxysporum f. sp. phaseoli. por meio de sua ligação a dois marcadores microssatélites. Este trabalho representa um primeiro relato da utilização destes marcadores para o mapeamento da murcha do fusário em feijoeiro comum. Microssatélites são descritos na literatura como marcadores altamente polimórficos. Embora isso seja comprovado em muitos trabalhos (HANAI et al., 2008), tal tendência não foi verificada neste estudo. Apenas 5,98 % dos locos marcadores testados revelaram diferenças alélicas entre as linhagens genitoras. Esse fato pode ter ocorrido devido a proximidade genética (ambos de origem Mesoamericanos) com backgrounds genéticos oriundos do mesmo tipo de grão comercial (carioca).   Conclusão   Embora a taxa de polimorfismo tenha sido baixa no cruzamento analisado, dois marcadores, PvM 066 e PvM 127, mostraram-se significativamente associados (p<0,000266 e p<0, 0037571) a genes de resistência a F. oxysporum f. sp. phaseoli. permitindo, assim, a utilização destes em programas de melhoramento genético do feijoeiro comum.   Referências  ABAWI, G. S. Root rots. In: SCHWARTZ, H. F.; PASTOR CORRALES, M. A. (Eds.). Bean production problems in the tropics. Cali: CIAT, 1989. p. 105-157.  ALZATE-MARIN, A. L. et al. Seleção assistida por marcadores moleculares visando ao desenvolvimento de plantas resistentes a doenças, com ênfase em feijoeiro e soja. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.30, n. 4, p. 333-342, ago. 2005.  BALSALOBRE, T. W. A.; CÂNDIDA, D. V.; EVANGELISTA, D. E.; COSTA, J. G. C.; CARNEIRO, M. S. Controle genético da resistência a Murcha-de-Fusário em feijoeiro comum. In: CONGRESSO NACIONAL DE PESQUISA DE FEIJÃO, 9., 2008, Campinas. Anais... . Campinas: ..., 2008. p. 01. CD-ROM.  CÂNDIDA, D. V. Controle genético da resistência à Fusarium oxysporium em feijoeiro comum. 2008. 60 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2008.  CRESTE, S.; TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A. Detection of single sequence repeats polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gel by silver staining. Plant Molecular Biology Reporter, Athens, v.19, n.4, p.299-306, dez. 2001. EDWARDS, M. D.; STUBER, C. W.; WENDEL, J. F. Molecular-marker-facilitated investigations of quantitative trait loci in maize: numbers, genomic distribution and types of gene action. Genetics, Bethesda, v. 116, p. 113-125, mai. 1987.  FERREIRA, L. G. Mapa genético do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) baseado em marcadores microssatélites e RAPD. 2006. 76 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular e Celular) - Programa de Pós-graduação em Biologia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2006.  HANAI, L. R. et al. Development, characterization, and comparative analysis of polymorphism at common bean SSR loci isolated from genic and genomic sources. Genome, Toronto, v. 50, n. 3, p. 266-277, mar. 2007.  HOISINGTON, D.; KHAIRALLAH, M.; GONZALEZ-DE-LEON, D. Laboratory protocols: CIMMYT applied molecular genetics laboratory. 2. ed. México: CIMMYT, 1994. 88p.  PEREIRA, H. S. Seleção assistida por marcadores microssatélites para produtividade de grãos em feijoeiro. 2006. 149 f. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2006.  RAVA, C. A.; SARTORATO, A.; COSTA, J. G. C. Reação de genótipos de feijoeiro comum ao Fusarium oxysporum f. sp phaseoli em casa de vegetação. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.21, n. 2, p.296-300, jun. 1996.  SALGADO, M. O.; SCHWARTZ, H. F.; BRICK, M. A. Inheritance of resistance to a Colorado race of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli in common beans. Plant Disease, Saint Paul, v. 79, n. 3, p.279-289, mar. 1995.           Figura 1. Perfil de marcadores microssatélites em linhagens de feijoeiro comum. Fig. 1A, marcador microssatélite PvM 062 não informativos nos genitores e bulks; Fig. 1B, marcador microssatélite  PvM 029 polimórfico entre os genitores, e não informativo nos bulks; e  Fig. 1C, marcador microssatélite PvM 127 polimórfico entres os genitores e nos bulks. PR = genitor resistente. PS = genitor suscetível. BR = grupo de plantas F2 resistente. BS = grupo de plantas F2 suscetível.   Tabela 1. Locos marcadores microssatélites associados à resistência à murcha do fusário do feijoeiro comum em casa de vegetação. Marcadores R2a Pb N. de indivíduos genotipados PvM 066 15,61 p<0,000266 99 PvM 127 6,54 p <0,037571 100 a porcentagem da variação fenotípica da resistência a F. oxysporum f. sp. phaseoli  explicada pela associação do loco marcador e o gene, estimada por regressão linear. b nível de probabilidade da análise de variância.    

Mapeamento genético da resistência a murcha do fusário em feijoeiro comum.

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