ALBUQUERQUE, P. S. B. de

ALVES, R. M.

SILVA, M. S. da C.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

Anais do 7º Seminário de Iniciação Científica da UFRA e 13º Seminário de Iniciação Científica da EMBRAPA 01 a 04 de dezembro de 2009 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS PARENTAIS DA PRÓXIMA CULTIVAR DE CUPUAÇUZEIRO, COM USO DE MARCADORES MOLECULARES DO TIPO MICROSSATÉLITES  Maria Suellem da Conceição Silva1, Rafael Moysés Alves2, Paulo Sérgio Bevilaqua de Albuquerque3    Resumo   A ampliação da base genética dos materiais de plantação é trabalho contínuo dos programas de melhoramento genético. Há necessidade, entretanto, que os parentais envolvidos estejem caracterizados fenotipicamente e genotipicamente para garantir os mecanismos de rastreabilidade e proteção das cultivares. O objetivo deste trabalho foi analisar a variabilidade genética dos clones de cupuaçuzeiro, utilizando marcadores microssatélites, que servirão como parentais da população melhorada de primeiro ciclo, a ser lançada pela Embrapa Amazônia Oriental. Foram estudados 16 clones de cupuaçuzeiro utilizando 14 locos heterólogos de microssatélites desenvolvidos para cacaueiro. Os resultados demonstraram a distribuição dos materiais em três grandes grupos, havendo concordância entre os grupos e procedência das matrizes dos clones. Foi detetada divergência entre os clones, apesar do estreito relacionamento genético.   Introdução  Entre as fruteiras nativas da Amazônia o cupuaçuzeiro, Theobroma grandiflorum (Willd ex Spreng) Schum, uma planta semi-umbrófila, destaca-se por se adaptar muito bem em consórcios com outras espécies perenes semi-perenes e provisórias (ALVES, 2003). A produtividade dos plantios de cupuaçuzeiro tem decrescido vertiginosamente nos últimos anos na região amazônica. Isto decorre, especialmente, pela susceptibilidade dos plantios ao fungo Moliniophthora (Crinipellis) perniciosa (Stahel) Singer, causador da doença denominada vassoura-de-bruxa. Essa doença tem provocado sérios prejuízos ao cultivo de cupuaçuzeiro na região amazônica (ALVES et al., 1998, SOUZA et al., 1998). Em 2002 a Embrapa Amazônia Oriental lançou as quatro primeiras cultivares de cupuaçuzeiro com resistência à vassoura-de-bruxa. Foram recomendados os clones Coari, Codajás, Manacapuru e Belém. O programa de melhoramento genético teve continuidade, ainda com foco na resistência e melhoria da produtividade, e prepara para os próximos anos o lançamento de uma nova cultivar, na forma de população melhorada de primeiro ciclo. Esta pesquisa teve por objetivo caracterizar geneticamente os parentais dessa população, para garantir a identidade dos materiais envolvidos, e conhecer a variabilidade genética entre eles.   Material e Métodos  Tecidos foliares dos 16 clones de cupuaçuzeiro selecionados foram levados ao laboratório de biotecnologia da CEPLAC, em Marituba – Pará, para extração de DNA. Foram avaliados os seguintes materiais: 32 - híbrido de 174 (Coari -AM) x 186 (Codajás - AM); 42 – híbrido de 186 (Codajás - AM) x 434 (Muaná - PA); 44 – híbrido de 186 (Codajás - AM) x 434 (Muaná - PA); 46 – híbrido de 186 (Codajás - AM) x 215 Anais do 7º Seminário de Iniciação Científica da UFRA e 13º Seminário de Iniciação Científica da EMBRAPA 01 a 04 de dezembro de 2009 (Manacapuru - AM); 47 – híbrido de 186 (Codajás - AM) x 1074 (Itacoatiara - AM); 48 – híbrido de 186 (Codajás - AM) x 1074 – (Itacoatiara - AM); 51 – híbrido de 215 (Manacapuru - AM) x 624 (Santarém - PA); 56 – híbrido de 186 (Codajás - AM) x 1074 (Itacoatiara - AM); 57 – híbrido de 186 (Codajás - AM) x 513 (Oiapoque - AP); 61 – híbrido de 228 (Manaus - AM) x 220 (Manacapuru - AM); 62 – híbrido de 185 (Codajás - AM) x 220 (Manacapuru - AM); 63 – híbrido de 174 (Coari - AM) x 248 (Itacoatiara - AM); 64 – híbrido de 185 (Codajás - AM) x 220 (Manacapuru - AM); 174 – clone primário (Coari - AM); 215 – clone primário (Manacapuru - AM); 1074 – clone primário (Itacoatiara - AM). A extração foi realizada segundo o protocolo CTAB de Doyle & Doyle (1990), modificado por Figueira et al. (1997) para espécies do gênero Theobroma. Para a amplificação do DNA foi utilizada a técnica de marcadores microssatélites, sendo testados primers desenvolvidos por Lanaud et al. (1999) para emprego em T. cacao. Quartoze primers de microssatélites que amplificam DNA de cupuaçuzeiro foram empregados, com base na seleção efetuada por Alves (2003) e em trabalho recentemente concluído. As reações foram preparadas com volume final de 13 l, contendo 15 ng de DNA genômico; 100 M de cada dNTPs; 0,2 M de cada primer (forward e reverse); tampão da enzima (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl pH 8,8; 0,1% Triton X-100; 1,5 mM MgCl2), e 1 unidade de Taq DNA polimerase. As reações foram amplificadas em termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, EUA), programado inicialmente com um ciclo de desnaturação a 94ºC por 4 min; seguido de 10 ciclos de 94°C por 40s, touch down, decrescendo 1ºC por ciclo, com temperatura de anelamento inicial de 59ºC e final de 49°C por 40s e 72°C por 60s; seguido de 30 ciclos de 94ºC por 30s, 46ºC ou 51ºC por 60s e 72ºC por 60s.  Os fragmentos amplificados foram separados em gel desnaturante de poliacrilamida à 6% e 7 M de uréia, corrido em cuba vertical. Inicialmente era realizada uma pré-corrida durante 10 minutos à 40W, e após a aplicação de 4l de cada reação no gel, era realizada a corrida, durante 3h à potência constante de 60W. A revelação do gel foi realizada com nitrato de prata, conforme Creste et al. (2001). As análises de distância/identidade genética foram realizadas utilizando o programa POPEGENE, versão 1.32 (YEH; BOYLE, 1997).  Resultados e Discussão  Foi obtido o perfil eletroforético de cada material utilizado, para servir como “fingerprint” de caracterização genética que garantirá a identidade e rastreabilidade dos materiais formadores da nova cultivar. Foram encontrados 41 alelos com a utilização dos 14 locos microssatélites  com média de 2,9 alelos/loco (Tabela 1). Os mais polimórficos foram os locos: mTcCIR 7, mTcCIR 25, mTcCIR 99 e mTcCIR 135. No dendrograma gerado a partir da distância genética de Nei (1978) foi possível verificar a existência de três grandes grupos (Fig. 1). O grupo mais externo apresenta o clone primário 1074 (Itacoatiara - AM), seu hibrido o clone 56 [186 (Codajás - AM) x 1074 (Itacoatiara - AM)] e o clone 63 [174 (Coari - AM) x 248 (Itacoatiara - AM)]. Um dos parentais do 63 (clone 248) é também oriundo de Itacoatiara - AM. Neste grupo observa-se, ainda, a presença do clone 51, identificado como híbrido de 215 (Manacapuru - AM) x 624 Anais do 7º Seminário de Iniciação Científica da UFRA e 13º Seminário de Iniciação Científica da EMBRAPA 01 a 04 de dezembro de 2009 (Santarém - PA). Entretanto ao analisarmos a matriz de dados dos alelos amplificados, verificamos que o clone 51 é incompatível com o parental 215 (Manacapuru - AM). No segundo grupo, foi verificado que todos os clones agrupados são híbridos do clone 186 (Codajás - AM). Como o relacionamento genético entre esses clones é de irmãos completos e meios irmãos, ficou comprovada a pouca distância genética entre eles. No terceiro grupo podemos observar a prevalência dos materiais provenientes da região de Manacapuru - AM. Além do clone primário 215 (Manacapuru – AM), agruparam os clones 61, híbrido de 228 (Manaus - AM) x 220 (Manacapuru - AM); 62 [híbrido de 185 (Codajás - AM) x 220 (Manacapuru-AM)] e 64, híbrido de 185 (Codajás - AM) x 220 (Manacapuru-AM). Destes, os clones 62 e 64 foram os mais próximos geneticamente, o que era esperado pois se trata de irmãos completos. Neste grupo observamos, ainda, o agrupamento do clone primário 174 (Coari – AM), com seu híbrido, o clone 32, (híbrido de 174 Coari - AM x 186 Codajás – AM). Os resultados deste trabalho servirão para orientar a distribuição das plantas na formação do pomar de sementes para a produção da população melhorada de primeiro ciclo. Plantas de um mesmo clone, ou plantas de clones que apresentem pouca distância genética, deverão ficar intercaladas por plantas de clones mais divergentes. Com essa estratégia serão induzidos cruzamentos entre materiais divergentes, minimizando a possibilidade de cruzamentos consaguineos.      Conclusões  Apesar do estreito relacionamento genético, houve boa divergência entre os clones que comporão a parentagem da próxima cultivar de cupaçuzeiro a ser lançada pela Embrapa Amazônia Oriental. O arranjo criterioso das plantas no campo, com base nas informações de distâncias genéticas, servirá para minimizar os riscos de produção de sementes endogâmicas.  Referências  ALVES, R.M.; STEIN, R.L.B.; ARAÚJO, D.G. de; PIMENTEL, L. Avaliação de clones de cupuaçuzeiro quanto à resistência a vassoura-de-bruxa. Revista Brasileira de Fruticultura, v.20, n.3, p.297-306, 1998.  ALVES, R.M. Caracterização genética de populações de cupuaçuzeiro Theobroma grandiflorum (Willd.ex.Spreng.) Schum., por marcadores microssatélites e descritores botânico-agronômicos. Piracicaba, 2003. 146p. Tese (Doutorado) ESALQ/USP  CRESTE, S.; TULMANN-NETO, A.; FIGUEIRA, A. Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant Molecular Biology Reporter, v.19, p.299-306, 2001.  DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v.12, n.1, p.1315, 1990.  FIGUEIRA, A.; LAMBERT, S.V.; CARPENTER, D.; PIRES, J.L.; CASCARDO, J.C.M.; ROMANCZYK, L. The similarity of cocoa flavour of fermented seeds from fingerprinted genotypes of Theobroma cacao from Brazil and Malaysia. Tropical Agriculture, v.74, n.2, p.132-139. 1997. Anais do 7º Seminário de Iniciação Científica da UFRA e 13º Seminário de Iniciação Científica da EMBRAPA 01 a 04 de dezembro de 2009  LANAUD, C.; RISTERUCCI, A.M.; PIERETTI, I.; FALQUE, M.; BOUET, A.; LAGODA, P.J.L. Isolation and characterization of microsattelites in Theobroma cacao L. Molecular Ecology, v.8, p.2141-2143, 1999.  NEI, M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from small number of individuals. Genetics, v.89, p.583-590, 1978.  PUGH, T.; FOUET, O.; RISTERUCCI, A.A.; BROTTIER, P.; ABOULADZE, M.; DELETREZ, C.; COURTOIS, B.; CLEMENT, D.; LARMANDE, P.; N´GORAN, J. A. K.; LANAUD, C. A new linkage map based on codominant markers: development and integrantion of 201 new microsatellite markers. Theoretical and Applied Genetics, Heideberg, v.108, n.5, p.1151-1161, Mar. 2004.  SOUZA, A. das G.C.; SILVA, S.E.L.; SOUZA, N.R. Avaliação de progênies de cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng, Schum) em Manaus. Revista Brasileira de Fruticultura, v.20, n.3, p.307-312, 1998.  YEH, F.C.; BOYLE, T.J.B. 1997. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits. Belgian Journal of Botany, v.129, p.157.   ANEXOS Tabela 1. Tamanho estimado dos alelos identificados (pb) na análise de 16 clones de cupuaçuzeiro, utilizando 14 locos microssatélites, em comparação à localização nos grupos de ligação do mapa consensual do cacaueiro (PUGH et al., 2004) e alelos clonados (LANAUD et al., 1999). Loco Grupo de ligação Alelo Clonado(pb) Alelos Estimados (pb) Nº Alelos mTcCIR 7   VII 160 147, 149, 150 e 152  4 mTcCIR 9  VI 274 295 e 310 2 mTcCIR 17 IV 271 280 e 292 2 mTcCIR 25 VI 153 134, 135, 147 e 170 4 mTcCIR 26 VIII 298 250, 265 e 270 3 mTcCIR 54 I 165 149, 150 e 151 3 mTcCIR 57 IV 253 260, 268 e 270 3 mTcCIR 99 VIII 249 270, 280, 288 e 300 4 mTcCIR 124 IX 131 155 e 162 2 mTcCIR 135 III 246 254, 260, 270 e 280 4 mTcCIR 162 III 162 190, 200 e 204  3 mTcCIR 220 X 201 225 e 230 2 mTcCIR 270 I 224 220 e 222 2 mTcCIR 286 I 119 290, 300 e 304   3   Anais do 7º Seminário de Iniciação Científica da UFRA e 13º Seminário de Iniciação Científica da EMBRAPA 01 a 04 de dezembro de 2009 132 <174 Coari AM x 186 Codajás AM>215 <Manacapuru AM>174 <Coari AM>61 <228 Manaus AM x 220 Manacapuru AM>62 <185 Codajás AM x 220 Manacapuru AM>64 <185 Codajás AM x 220 Manacapuru AM>44 <186 Codajás AM x 434 Muaná PA>48 <186 Codajás AM x 1074 Itacoatiara AM>42 <186 Codajás AM x 434 Muaná PA>47 <186 Codajás AM x 1074 Itacoatiara AM>46 <186 Codajás AM x 215 Manacapuru AM>57 <186 Codajás AM x 513 Oiapoque –AP>63 <174 Coari AM x 248 Itacoatiara AM>1074 <Itacoatiara AM>51 <215 Manacapuru AM x 624 Santarém PA>56 <186 Codajás AM x 1074 Itacoatiara AM> Figura 1. Dendrograma baseado na distância genética de Nei (1978), utilizando o método de médias das distâncias (UPGMA). 

Caracterização molecular dos parentais da próxima cultivar de cupuaçuzeiro, com uso de marcadores moleculares do tipo microssatélites.

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