BUSS, S.

DEGENHARDT-GOLDBACH, J.

DUTRA, L. F.

FRANCISCON, L.

STACHEVSKI, T. W.

WENDLING, I.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Calogênese in vitro a partir de folhas de erva-mate (Ilex paraguariensis St.Hil.) mantidas em casa de vegetação.

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61CALOGÊNESE IN VITRO A PARTIR DE FOLHAS DE ERVAMATE (Ilex paraguariensisSt.Hil.) MANTIDAS EM CASA DE VEGETAÇÃODegenhardt-Goldbach, JI.; Stachevski, T.w.2; Franciscon, L.3; Buss, S.4;Wendling, e;Dutra, L.F.5 ,'Pesquisador da Embrapa Florestas, Estrada da Ribeira km 111·· Cl!P 83411-000, Colombo, PRjuliana@cnpf.embrapa.com.br2Aluna do curso de Biologia da Pontifícia Universidade Católica do Paraná.3Analista, estatística da Embrapa Florestas"Aluna de Graduação do curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, UFPR5Pesquisadora da Embrapa Clima TemperadoResumoEste trabalho objetivou avaliar a indução in vitro de calogênese em folhas de erva mate.Inicialmente foi avaliada a calogênese em função do tamanho de folhas em meio Y4 MS, com 30 g/L desacarose, 0,1 g!L de mio-inositol 1 mg/L BAP, 0,2 mg/L ANA e 7 g/L de agar. A seguir, folhas de plantasde 2 e 10 anos foram utilizadas para avaliar o efeito de fitorreguladores no mesmo meio anterioradicionado de: zeatina (0,5; 1,0 ou 2,0 mg/L); BAP (0,5; 1,0 ou 2,0 mg/L) ou 2iP (0,5; 1,0 ou 2.0 mg/L)combinados ou não com 1,0 mg/L de 2,4D. Observou-se que folhas de tamanho médio apresentarammenor porcentagem de necrose, mas não foram observados calos no meio testado. No segundoexperimento, houve indução de calos em meios que continham a combinação de 2,4 D com zeatina ou 0,5mg/L de 2ip, independentemente da idade das mudas.Palavras-chave: organogênese; idade do explante; citocininas; auxinasIn vitro CALLOGENESIS OF YERBA MATE (Ilex paraguariensis St. Hil.) LEAVES FROMGREENHOUSE PLANTSAbstractWas evaluated the in vitro callus induction on leaves ofyerba mate. In the first experiment, callusinduction was evaluated regarding the size of leaves on Y4 MS medium with 30 g/L sucrose, 0.1 g!L myo-inositol l mg!L BAP, 0,2 mg/L NAA and 7 g/L agar. In the second experiment, leaves of 2 and 10 yearsplants were used to evaluate the effect of growth regulators in the same medium as before supplementedwith: zeatin (0.5, 1.0 or 2.0 mg/L), BAP (0.5; 1.0 or 2.9 mglL) or 2iP (0.5, 1.0 or 2.0 mg!L) combined ornot with 1.0 mg!L 2,4 D. Leaves of average size showed a lower percentage of necrosis, but noregeneration was observed in the first experimento In the second experiment, was observed callusinduction on media containing a combination of 2.4 D with zeatin or 0.5 mg/L 2ip, regardless the age ofseedlings.Keywords: organogenesis; explant age; citokinins, auxinsIntroduçãoA erva mate (Ilex paraguariensis St. Hil) é nativa da Floresta Ombrófila Mista Montana (Florestacom Araucária) e raramente encontrada em Floresta Ombrófila Densa (Floresta Atlântica). Suas folhaspossuem um teor de cafeína não inferior ao do café, das quais se prepara o chimarrão, o tereré ou o chámate. Nelas são encontradas também os taninos que dão o sabor adstringente desta bebida, além dealcalóides (Simões et aI., 1998).A multiplicação a partir de sementes é normalmente dificultada pela dormência em virtude daimaturidade do embrião, além de dormência tegumentar, devendo passar por um período de estratificação(Fowler & Sturion, 2000). Além disso, as sementes apresentam baixa qualidade genética e fisiológica(Sturion, 1988; Menna, 1995) e não são indicadas para iniciarem plantios, devido à alta variabilidadegenética.62Técnicas de cultura de tecidos permitem diminuir o tempo de produção, auxiliam nomelhoramento genético e podem ser consideradas ferramentas biotecnológicas para o estudo dometabolismo, fisiologia, desenvolvimento e reprodução de plantas de interesse comercial. Estas técnicastambém são muito utilizadas para a clonagem de espécies nativas e exóticas (Sado, 2009).A micropropagação de erva mate a partir da introdução de segmentos nodais vem sendo relatadana literatura (Zaniolo e Zanete 1999; Horbach, 2008; Cuquel, 1993, Sansberro et aI., 2001; Rey et aI.,1991) e representa um método importante de resgate de material adulto. No entanto, este método aindaapresenta várias lacunas, entre elas as altas taxas de contaminação na introdução, baixas. taxas demultiplicação e bactérias endógenas que aparecem ao longo dos subcultivos. Portanto, outras técnicas decultura de tecidos devem ser investigados para avaliar a viabilidade da obtenção de métodos depropagação vegetativa mais eficientes para esta espécie.Um aspecto importante da capacidade adaptativa dos vegetais é a competência de iniciar a divisãocelular a partir de qualquer tecido e regenerar órgãos perdidos ou mesmo poder se diferenciar emqualquer célula especializada como resposta a um determinado estímulo (Huey et al. 2003).A indução de calos em diferentes tecidos vegetais pode ocorrer inoculando-se explantes dequalquer parte da planta em meio de cultura com o estímulo de reguladores de crescimento ocorre aindução de crescimento, modificando o metabolismo celular. Nesse processo, a diferenciação e aespecialização celular são revertidas e o explante dá início a um novo tecido composto por célulasmeristemáticas não especializadas. Embora o calo continue desorganizado durante a multiplicação celular,alguns tipos de células especializadas podem ser formados ao acaso por meio de centros de morfogênese.Essas células especializadas são capazes de iniciar a formação de órgãos como raízes, brotos e embriõessomáticos (George et al. 2008). Tecidos jovens meristemáticos são os mais indicados, mas é possívelobter calogênese a partir de fragmentos já diferenciados (Loyola-Vargas & Vazquez-Flota 2006; George etal. 2008) ..A embriogênese somática é uma técnica de cultivo in vitro capaz de multiplicar clones elite. Essatécnica apresenta vantagens sobre as demais técnicas de micropropagação, como a capacidade de produzirgrande número de embriões num espaço limitado e o desenvolvimento direto de plantas a partir deembriões individualizados (Guerra et. al., 1999). É um processo no qual células isoladas, ou um pequenogrupo de células somáticas, dão origem a embriões, num processo morfogenético que se aproxima da.seqüência de eventos representativos da embriogênese zigótica. A indução e o controle da embriogênesesomática são dependentes do genótipo da planta matriz, da fonte e idade do explante, e do tipo econcentração dos reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura (Guerra et al. 1999).A micropropagação da erva mate através de embriogênese somática poderia fomentar programasde melhoramento genético e diminuir o risco de perda de material genético, a partir da conservação invitro. Embriões somáticos já foram obtidos a partir de embriões imaturos, tanto de forma direta (sem aformação de calos), quanto de forma indireta (Rey et aI., 2002). A calogênese é uma etapa para odesenvolvimento de sistemas de propagação massiva de plantas por organogênese ou embriogênesesomática.Este trabalho teve por objetivo avaliar a indução de calos em folhas de plantas de erva mate dedois ou dez anos mantidas em casa de vegetação de diferentes tamanhos e sob diferentes concentrações defitorreguladores.Material e métodos1. Material vegetalOs experimentos foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da EmbrapaFlorestas, Colombo, PRo Foram utilizadas plantas matrizes cultivadas em minijardim clonal, em sistemasemihidropônico, em casa de vegetação. Foram utilizadas plantas de dois anos, obtidas a partir desementes, e plantas de 10 anos, originadas por estaquia de plantas a campo selecionadas pelo programa demelhoramento da erva mate da Embrapa Florestas. .2. Calogênese a partir de folhasAs folhas foram coletadas em solução de ácido ascórbico (0,5 g/L) e ácido cítrico (0,5 g/L). Nolaboratório foram inicialmente imersas em solução de álcool 70% por I minuto seguido de solução de63NaCIO 2,5% por 20 minutos. Após tríplice lavagem com água bidestilada e autoc1avada, as folhas foramcortadas com auxílio de bisturi no sentido longitudinal, e então colocadas em placas de petri com a faceadaxial voltada para o meio de cultura, conforme os respectivos tratamentos. As folhas foram mantidas noescuro com temperatura de 23°C ± 2 °C por duas semanas e então colocadas em sala de crescimentó sobfotoperíodo de 16 horas.3. Influência do tamanho das folhas de erva mate na indução de calosFolhas de plantas de 2 anos de idade de diferentes tamanhos foram utilizadas, sendo as pequenascorrespondentes às duas folhas mais jovens das plantas (recém emitidas), folhas médias, as duas folhas aseguir e -folhas grandes, as 2 folhas logo abaixo destas. Foram utilizados 5 explantes por placa, com 5placas por tratamento.O meio de cultura utilizado foi o Y4 MS (Murashige e Skoog, 1962) contendo 30 g L-I de sacarose, 0,1 mgL-I de mioinositol, 1 mg L-I de BAP (6-benzil aminopurina), 0,2 mg L-I de ANA (ácido naftalenoacético),e 7 g L-I de ágar. Após 15 dias foi avaliada a contaminação dos explantes por fungos ou bactérias, aformação de calos e a quantidade de explantes necrosados.Os dados do experimento foram analisados por meio da análise de deviance. A distribuição deprobabilidade usada foi a binomial, o modelo mediu os efeitos de tratamentos para as variáveis. Ascomparações entre os tratamentos foi feita através de contrastes ortogonais.Efeito de fitorreguladores e da idade da planta matriz na calogênese in vitro de erva mateForam utilizadas plantas matrizes de 2 ou de 10 anos. Foram testados diferentes fitorreguladores econcentrações acrescidos ao meio Y4 MS contendo 30 g L-I de sacarose, 0,1 mg/L de mioinositol, e 7 g L-Ide ágar, conforme os seguintes tratamentos:TO- sem fitorreguladores; TI-zeatina 0,5 mg L-I; T2- zeatina 0,5 mg L-I+ 1 mg L-I 2,4 D (ácidodic1orofenoxiacético); T3- zeatina 1,0 mg L-I; T4- zeatina 1,0 mg L-I+ I mg L-I 2,4 D; T5- zeatina 2,0 mgL-I; T6- zeatina 2,0 mg L-I+ I mg L-I 2,4 D; T7-BAP 0,5 mg L-I; T8- BAP 0,5 mg L-I+ 1 mg L-I 2,4 D;T9- BAP 1,0 mg L-I; TI 0- BAP 1,0 mg L-I+ 1 mg L-I2,4 D; TI1- BAP 2,0 mg L-I; TI2- BAP 2,0 mg L-1+ 1 mg L-I 2,4 D; TI3-2ip (ô-ê-ô-dimetilamilalino-purina) 0,5 mg L-I; TI4-2ip 0,5 mg L-I+ 1 mg L-I 2,4D; TI5-2ip 1,0 mg L-I; TI6-2ip 1,0 mg C1 + 1 mg L-I 2,4 D; TI7-2ip 2,0 mg i.', TI8-2ip 2,0 mg L-I+ ImgL-12,4D.Foram utilizadas 3 placas por tratamento, com 5 explantes por placa. Após 30 dias foi avaliada apresença de calos nos explantes.Resultados e Discussão1. Influência do tamanho das folhas de erva mate na indução de calosPara avaliar a possibilidade de utilização de folhas de erva mate mantidas in vitro para indução decalos, folhas de diferentes tamanhos/idades foram utilizadas.Foram avaliadas folhas de 3 tamanhos diferentes (Tabela 1). A porcentagem de explantes oxidados foiinfluenciada pelo tamanho das folhas. Folhas de tamanho médio apresentaram a menor porcentagem deoxidação, indicando que estas folhas devem ser preferidas para indução de calos para embriogênesesomática ou organogênese. Normalmente, explantes mais jovens tendem a responder melhor aostratamentos de indução de calos. No entanto, as folhas muito jovens demonstraram sofrer maisintensamente com a oxidação.De acordo com a análise de contrastes ortogonais, a oxidação em folhas médias difereestatisticamente das pequenas e grandes quando avaliadas em conjunto, e de folhas grandes isoladamente.Com relação à contaminação por fungos, também houve diferença com relação ao tamanho das folhasutilizadas. As folhas grandes apresentaram menor contaminação por fungos em relação às demais, mas noentanto apresentaram 80% de oxidação.Não foi observada contaminação por bactérias. No meio avaliado, não houve formação de calosem nenhum dos tratamentos.642. Efeito de fitorreguladores e da idade da planta matriz na calogênese in vitro de erva mateCom relação aos fitorreguladores testados na indução de calos, na maioria dos tratamentos, aresposta de indução de calos foi independente da idade das plantas (Tab. 2). O 2,4D demonstrou serindispensável para a indução de calos em combinação com a zeatina ou o 2ip.Dentre as citocininas testadas, a zeatina foi a mais eficiente, quando combinada com o 2,4D. Emtodas as concentrações testadas houve a formação de muitos calos friáveis. Na presença de zeatina sem aadição de auxina Rey et aI. 2002 induziram a formação de calos embriogênicos a partir de embriõestratados previamente com colchicina, trifluralina ou oryzalina. A obtenção de embriões somáticos a partirde embriões zigóticos imaturos de forma direta ou indireta foi possível também para Ilex aquifolium, ICornuta e I opaca sem a adição de fitorreguladores (Hu & Sussex, 1971; Hu et aI., 1978; Hu, 1989).Em Rosa hybrida, a combinação de zeatina e 2,4D também possibilitou a formação de embriõessomáticos (Burrell et aI., 2006).Em Quercus suber, a adição de 9 11M de zeatina e 4,5 11M de 2,4D possibilitaram a formação deembriões somáticos a partir de folhas de plantas de 60 anos de idade. Para esta espécie os autores tambémobservaram pouca ou nenhuma formação de calos na presença de BAP e L,4D (Pinto et aI., 2002). Paraesta espécie, a combinação de 4,5 mM de 2,4-D e 9.1 mM de zeatina foram ainda eficientes na induçãode embriões somáticos a partir de folhas de plantas de 3 anos de idade (Pinto et aI., 2001).Na presença de 2iP houve a formação de alguns calos na menor concentração da citocinina, ouem folhas jovens, na presença de alta concentração, na ausência de 2,4D.Para os tratamentos com BAP, houve a formação de calos apenas na ausência da auxina, e emconcentrações diferentes para folhas de plantas jovens ou velhas. Folhas de plantas velhas exigiram maiorconcentração desse fitorregulador para a formação de calos. Estes resultados corroboram aqueles obtidosno primeiro experimento, onde BAP na presença de auxina não foi eficiente na indução de calos.Tabela 2 - Formação de calos induzidos in vitro em folhas de erva mate de plantas de dois ou de~ anos deidade (jovens e velhas, respectivamente) em meios de cultura contendo zeatina, BAP ou 2iP nasconcentrações de 0,5; 1,0 ou 2,0 mg L-I na presença ou ausência de 1 mg L-I de 2,4D.P - presença de calos; A - ausência de calosConclusões- As folhas de tamanho médio foram as mais adequadas para indução de calogênese, por apresentarem asmenores taxas de necrose;- A combinação de zeatina e 2,4D foi a mais favorável para a formação de calos em folhas;- Apesar da formação de calos, não foi encontrado o balanço hormonal propício ao desenvolvimento deembriões somáticos e, portanto, outros fitorreguladores devem ser avaliados.Referências bibliográficasBurrell AM, Lineberger RD, Rathore KS, Byrne DH (2006) Genetic variation in somatic embryogenesisofrose. 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