CARVALHO, E. M.

FERNANDES, F. T.

MACHADO, J. da C.

OLIVEIRA, E. de

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A Mancha Por Phaeosphaeria Em Milho No Brasil: Evidências DeUm Novo Agente EtiológicoPrevious  Top Next ELIZABETH DE OLIVEIRA1, FERNANDO TAVARES FERNANDES1, ENIA MARACARVALHO2 e JOSÉ DA CRUZ MACHADO2.   1 Embrapa Milho e Sorgo. Caixa Postal 151, CEP 35701-970 Sete Lagoas, MG. E-mail:beth@cnpms.embrapa.br tavares@cnpms.embrapa.br  2 Depto de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras. Caixa Postal 37, CEP 37200-000 Lavras, MG. E-mail: machado@ufla.br   Palavras-chave: Sclerophthora, Peronosporaceae, esporângio, zoosporos, Phyllosticta   INTRODUÇÃO  A Mancha por Phaeosphaeria em milho foi descrita pela primeira vez, na Índia, em 1965,assumindo-se como seu agente causal o fungo Phaeosphaeria maydis, f.imp. Phyllostictasp (=Sphaerulina maydis P. Hennigs; sin. Leptosphaeria zae-maydis Saccas) (Rane et al.,1965). Desde que a Mancha por Phaeosphaeria em milho foi descrita, na Índia, suaocorrência no Brasil tem sido relatada em várias publicações (Balmer et al., 1970;Fernandes & Sans 1994, Shuelter et al. 2003). Essa doença é uma das mais importantesem milho, no Brasil, uma vez que, encontra-se disseminada nas principais regiõesprodutoras desse cereal e, que, sob condições favoráveis, causa perdas severas(Fernandes & Oliveira, 1997). Contudo, o agente etiológico dessa doença permaneceainda questionável. Sob condições experimentais, várias tentativas de inoculação deesporos e/ou micélio de P. maydis ou Phyllosticta sp, obtidos em cultivo 'in vitro", emmilho, não resultaram na reprodução de sintomas dessa doença (Fernandes, F. T. dadosnão publicados). Além disso, a presença de estruturas desses fungos em lesões da doençanão é comum, e, recentemente, a possibilidade de envolvimento de uma bactéria naetiologia da doença foi levantada Paccola-Meirelles et al. (2001). Considerando essesaspectos, o objetivo desse trabalho foi examinar lesões da Mancha por Phaeosphaeria emmilho, sob microscopia ótica e eletrônica, para verificar a possivel presença de fungo oubactéria como possível agente etiológico dessa importante doença.   MATERIAL E MÉTODOS  Caracterização dos sintomas e desenvolvimento da Mancha por Phaeosphaeria noBrasil: Os sintomas e sinais geralmente se iniciam após o florescimento do milho, maisfreqüentemente, durante o desenvolvimento dos grãos. As primeiras lesões podem serobservadas nas folhas inferiores e, sob condições favoráveis, a doença progride para asfolhas superiores. A severidade dos sintomas depende da susceptibilidade do genótipo demilho, e nas cultivares mais susceptíveis as folhas doentes secam antes da maturidade. Aslesões jovens são verde-claro a marron-claro, encharcadas, e aumentam em tamanho,tornando-se manchas secas, de cor palha. Ambas lesões, jovens e velhas, são geralmentearredondadas ou elípticas, espalhadas na superfície da folha e, em poucos casos,coalescem O tamanho das lesões é variável de 0,3 a 2,0 cm. Em alguns genótipos muitosusceptíveis, as lesões podem ultrapassar 2,0 cm e tornarem-se irregulares, embora aindacom delineamento, aparentemente, elíptico. Amostragem e análises: No período desetembro de 2000 a fevereiro de 2004 foram coletadas folhas de milho com lesões daMancha por Phaeosphaeria, em diferentes genótipos, em diferentes meses, abrangendo asafrinha e a safra de verão, na área da Embrapa Milho e Sorgo, em Sete Lagoas, MG.Essas amostras foram utilizadas para exame sob microscopia de luz e microscopiaeletrônica. Microscopia eletrônica de varredura (MEV): Lesões da Mancha porPhaeosphaeria foram cortadas em fragmentos e esses fixados em fixador de Millonigs,por uma noite a 40C, e pós fixados por 1h em tetróxido de osmio (2%). Esses fragmentosforam desidratados através de imersões sucessivas em uma série álcool-acetona, (25, 50,75%) e posteriormente em acetona 100%, por 20 min em cada concentração, então secasno secador "ponto crítico", e metalizadas com ouro, após fixadas nos porta-espécimenspara análise ao MEV. Um total de 80 amostras, incluindo lesões jovens e velhas, foramanalisadas ao MEV. Microscopia eletrônica de transmissão (MET): Dez pequenosfragmentos (cerca de 0,1 x 0,2 cm) de lesões da Mancha por Phaeosphaeria em milho,fixadas e desidratadas, como descrito acima, foram embebidas em resina spurr. Secçõesultrafinas, obtidas em ultramicrótomo, foram coradas com acetato de uranila e citrato dechumbo, para análises ao MET (Hayat, 1989). Microscopia de luz: Muitas amostrasforam diretamente analisadas sob microscópio ótico estereoscópico e sob microscópiocomposto. Para o microscópio composto, várias lâminas de vidro foram preparadas,contendo estruturas removidas das lesões, sob estereomicroscópio, usando lactofenol ouazul tripano em lactofenol 0,1%. Ainda, pequenas secções de folhas contendo lesõesnecróticas e cloróticas (encharcadas) foram examinadas após aquecimento em lactofenolclaro e coloração com azul de Aman (0,1%), para observar hifas e outras estruturas nointerior dos tecidos. Incubação "in vitro": Algumas lesões da Mancha porPhaeosphaeria foram superficialmente esterilizadas por imersão em cloramina T 1,5%,por 10 min e lavadas três vezes com água esterilizada, seguindo-se incubação em meiobatata-dextrose-agar (BDA), a 250C, com fotoperíodo de 12h claro e 12h escuro.Algumas estruturas esféricas, encontradas sobre as lesões foram também removidas compinça e incubadas em gotas de água, em lâminas escavadas. Outras estruturas esféricas,removidas das lesões, foram incubadas em agar-água 1% em placa de Petri.   RESULTADOS E DISCUSSÃO  Em todas as amostras analisadas ao MEV, peritécios de Phaeosphaeria maydis epicnídios de Phyllosticta sp não foram encontrados. Contudo, estruturas de um fungo,aparentemente pertencente à Divisão Mastigomycotina foram encontradas em todas asamostras examinadas. Várias dessas estruturas foram identificadas como parte do ciclo devida dessa espécie, como se segue: 1- Esporângio produzido na extremidade de umesporangióforo, com forma arredondada (diâmetro 23,9µm), com um orifícioarredondado, ornamentado com espinhos. Esporângios colapsados apresentaram diâmetrovariável de 11,74 a 19,70µm; 2- Zoosporos com formato reniforme e com remanescentesde flagelos (3,2-3,5µm x 1,7–2,0µm). 3- Oocito com parede ornamentada (diâmetro10,4µm – 12,5µm); 4- Hifa muito fina (diâmetro 1,4µm a 2,0µm), sem septo visível,exceto na base do esporangióforo; ramificada, freqüentemente penetrando através deestômatos. Desenvolvimento do micélio sob e sobre a cutícula foliar. A ocorrênciasimultânea desse micélio fino e de, ao menos uma das estruturas reprodutivas(esporângio, oocito) (Figura 1) foi confirmada em 100% de todas as amostras analisadas.Em geral, o desenvolvimento do fungo foi mais intenso nas lesões jovens, em relação àslesões mais velhas. Nas amostras examinadas ao MET, apenas uma fina hifa, não septada,foi observada no interior de células do mesófilo, deterioradas. O exame sob microscópioestereoscópico permitiu (Figura 2) a observação de pequenas estruturas arredondadas, decolaração rosada ou amarelo-brilhante que, quando observadas sob microscópiocomposto, apareceram como estruturas hialinas, ornamentadas com espinhos e possuindoum orifício, sendo interpretadas como os mesmos esporângios observados ao microscópioeletrônico de varredura. Hifas finas, coradas em azul, foram observadas nas lesõessubmetidas à clarificação por aquecimento em lactofenol, com magnificação 400X. Ofungo Phaeosphaeria maydis não foi isolado das lesões incubadas em BDA. Também nãocresceu em meio BDA, qualquer fungo produzindo esporângios ou oocitos, semelhantesàs estruturas observadas sob microscopia ótica e eletrônica. Nas preparações feitas emgota d'água em lâmina escavada, estruturas moveis, como zoosporos, foram observadasdois dias após incubação. O fungo encontrado foi identificado como uma espécie nova nogênero Sclerophthora (Peronosporaceae) (Ainsworth et al. 1973; Schaw, 1978;Alexopoulos et al. 1996) e considerada elevada a probabilidade, de ser esse o agentecausal da doença, até então denominada "Mancha por Phaeosphaeria". Outros estudossão necessários para confirmação da identidade desse organismo, e de seu papel naetiologia da doença.   LITERATURA CITADA  ALEXOPULOS, C. J.; MIMS, C. W.; BLACWELL, M. Introductory mycology 4.ed.New York: J. Wiley , 1996. 869 p.   AINSWORTH, G.C.; SPARROW, F.K.; SUSSMAN, A.S. The fungi an advancedtreatise. New York: Academic Press, 1973. v. IVB: A taxonomic review with keys:Basidiomycetes and lower fungi. 504 p.   BALMER, E. Doenças do milho. In: GALLI, F. (Coord.) Manual de Fitopatologia:  doenças das plantas cultivadas. São Paulo: Agronômica Ceres, 1980. cap. 27, p  371-391.   FERNANDES, F. T.; OLIVEIRA, E. Principais Doenças na Cultura de Milho. SeteLagoas: EMBRAPA – CNPMS, 1997. 80 p. (EMBRAPA-CNPMS. Circular Técnica,26).   FERNANDES, F.T.; SANS, L.M.A. Influência das condições climáticas na ocorrênciadas lesões foliares por Phaeosphaeria maydis. In: CONGRESSO NACIONAL DEMILHO E SORGO, 20, 1994, Goiânia. Resumos... Goiânia, GO.ABMS/EMGOPA/EMBRAPA-CNPMS/UFG/ Emater-GO, 1994. p. 136.   HAYAT, M.A. Principles and techniques of electron microscopy: BiologicalApplications. 3.ed. Boca Raton: CRC Press, 1989. 469 p.   PACCOLA-MEIRELLES, D. L., FERREIRA, A. S.,MEIRELES, W.F., MARRIEL, I.E.,  CASELA, C. R. Detection of a bacterium associated with a Leaf Spot Disease of  maize in Brazil. Journal Phytopathology, Berlin, v. 149, p. 275-279, 2001.   RANE, M.S.; PAYAK, M.M.; RENFRO, B.L.A. Phaeosphaeria leaf spot of maize. [  s.l.]: Indian Phytopathological Society, 1965. 10 p. (Bulletin, 3).   SHAW, C. G. Peronosclerospora species and other downy mildews of the graminae.Mycologia, New York, v. 70, p. 594-604, 1978.   SHUELTER, A. R.; SOUZA, I. R. P.; TAVARES, F. F.; SANTOS, M. X. dos ;OLIVEIRA, E.; GUIMARÃES, C. T. Controle genético da resistência do milho àmancha por Phaeosphaeria. Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v.2, n.1,p.80-86, 2003.              

A mancha por Phaeosphaeria em milho no Brasil: evidências de um novo agente etiológico.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/488277/1/Manchaphaeosphaeria.pdf

A mancha por Phaeosphaeria em milho no Brasil: evidências de um novo agente etiológico.

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