Cui, LQ

Han, QX

Liu, L

Wang, M

Wang, XJ

University of Liverpool Repository

3 基金项目 :山东省自然科学基金资助项目 ( Y2003C01)水蛭素对凝血酶诱导血管内皮细胞与中性粒细胞表达黏附分子的影响 3王 　敏1 ,崔连群2 ,王晓军2 ,韩秋霞1 ,刘鲁宁3(1 山东科技大学信电学院生物医学系 ,济南 250031 ;2 山东大学临床医学院省立医院 , 济南 250021 ;3 山东大学生命科学院 ,济南 250100)　　[摘要 ] 　目的 :研究水蛭素对凝血酶诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 表达细胞黏附分子 ( ICAM21) 和中性粒细胞表达膜整合素 CD11b 的影响。方法 :用酶消化法获得 HUVEC ,密度梯度离心和重力沉降法分离人外周血细胞中性粒细胞。用酶联免疫吸附测定 HUVEC在凝血酶、水蛭素作用下 ICAM21 的变化 ,同时以免疫荧光流式细胞术检测中性粒细胞表达 CD11b 水平的变化。结果 :与对照组相比 ,凝血酶诱导的 HUVEC 表达 ICAM21 显著增多 ,随时间延长 , ICAM21 的表达递增 ,高峰在 24 h。凝血酶使中性粒细胞 CD11b 的表达也显著上调 ,6 h 平均荧光强度明显增加 ,随时间延长逐渐升高 ,高峰在 24 h。水蛭素和肝素对凝血酶诱导的 HUVEC 表达 ICAM21 和中性粒细胞表达CD11b 均有明显的抑制作用 ,且水蛭素抑制 ICAM21 的表达强于肝素 ,尤其在 ICAM21 表达的高峰期 ,对 CD11b 表达的抑制作用水蛭素与肝素无明显差别。结论 :水蛭素可以明显抑制凝血酶诱导的 HUVEC 表达 ICAM21 和中性粒细胞表达 CD11b。　　[关键词 ] 　凝血酶 ;水蛭素 ;细胞黏附分子[中图分类号 ] R96511 ,R97312 　　[文献标识码 ] A 　　[文章编号 ] 1003 - 3734(2005) 08 - 0989 - 04Effects of hirudin for the thrombin2induced expression of adhesivemolecules in neutrophils and human umbilical vein endothelial cellsWANG Min1 ,CUI Liang2Qun2 ,WANG Xiao2jun2 ,HAN Qiu2xia1 , LIU Lu2ning3(1 Department of Biological Medicine , Shandong University of Science and Technology ,Jinan 250031 , China ;2 Department of Cardiology , The Provincial Hospital Affiliatedto College of Clinical Medicine , Shandong University ,Jinan 250021 , China ;3 Institute of Life Science , Shandong University , Jinan 250100 , China)[ Abstract ] 　Objective : To investigate effects of hirudin for the thrombin2induced expression ofintercellular adhesive molecules21 ( ICAM21) in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and clusterof differentiation (CD) 11b in neutrophil granucytes. Methods : The HUVEC was purified by digestion withcollagenase type I. An enzyme linked immunosorbent assay was used to analyze the expression of ICAM21thrombin promoted in the HUVEC. The neutrophil granucytes were purified by density gradient centrifugationand gravimetric sedimentation. An immunofluorence flow cytometery was utilized to observe the expression ofCD11b thrombin induced in the neutrophil granucytes. Hirudin was incubated with the HUVEC and neutrophilgranucytes , and the changes of ICAM21 and CD11b were monitored , respectively. Results : Thrombinsignificantly increased both CD11b and ICAM21 levels with the maximal peak values at 24 hours , which werepositively proportional to the time thrombin exposed to the HUVEC and neutrophil granucytes. Hirudininhibited the expression of ICAM21 in the HUVEC more greatly than heparin , and CD11b in the neutrophilgranucytes the same as heparin. Conclusion : Hirudin inhibited the generation of both ICAM21 and CD11b byaltering leukocyte adhesion and migration , which suggested affecting the atherosclerotic process.[ Key words ] 　thrombin ;hirudin ;intercellular adhesive molecules—989—　Chinese Journal of New Drugs 2005 ,Vol . 14 No. 8 中国新药杂志 2005 年第 14 卷第 8 期　　　凝血酶作为一种重要的血管活性物质 ,通过损伤内皮细胞、促进平滑肌细胞增殖及血管壁细胞释放细胞因子和基质金属蛋白酶[1～5 ] 等 ,在动脉粥样硬化 (Atherosclerosis ,As) 的发生、发展过程起到了举足轻重的作用。在研究 As 过程中 ,凝血酶与黏附分子的关系也日益受到重视。血液中白细胞穿过内皮迁移至血管壁间隙是 As 形成的必要步骤 ,白细胞与内皮细胞黏附是此过程中重要的一环。本研究检测了凝血酶诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞 (humanumbilical vein endothelial cells ,HUVEC) 表达细胞黏附分子 (intercellular adhesion molecule21 , ICAM21) 和中性粒细胞表达膜整合素 CD11b ,及其水蛭素对此过程的抑制作用 ,旨在探索凝血酶与 As 发生、发展的分子机制 ,为防治 As 的新途径提供理论基础。材料与方法1 　试剂与仪器凝血酶 ,胶原酶 I 型 ,胰蛋白酶 ,DMEM 培养基 ,Sigma 公司产品。重组水蛭素 (12 500 u·mL - 1 ) 由山东阿华生物药物有限公司馈赠。胎牛血清 ,杭州四季青公司产品。淋巴细胞分离液〔密度 (11077 ±01002) g·mL - 1〕,上海荣盛生物技术有限公司产品。粒细胞分离液 (Dextran T500 溶液) ,美国 Pharma 公司产品。鼠抗人 FITC(异硫氰酸荧光素)标记 CD11b单 克 隆 抗 体 及 FITC 标 记 羊 抗 鼠2IG1 , 法 国Immunotech 公司产品。ELISA 法检验 ICAM21 试剂盒 ,美国 R&D 产品。超净工作台 (J HT) 、CO2 培养箱(Nuare) 、倒置相差显微镜 (Olympus) 酶联免疫检测仪 (BIORAD 550) 、低温超速离心机 ( IEC , miceomanRF) 。2 　方法211 　HUVEC的体外培养 　无菌取分娩 4h 内健康新生儿脐带 ,用 D2Hanks 液冲洗脐静脉腔 , 注入011 %胶原酶溶液 ,封闭两端置 37 ℃的 D2Hanks 液中消化 10 min。离心 ,弃上清液。加入含 20 %胎牛血清DMEM 的培养液 ,调整至细胞密度为 2 ×109 个·L - 1 ,接种于培养瓶中 ,在 CO2 孵育箱内 37 ℃时培养。用 Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定内皮细胞。第 2～5 代细胞作为实验用细胞。用培养液调整细胞密度为 2 ×109 个·L - 1 ,接种在培养瓶或培养板内的盖玻片上 ,培养至 80 %的细胞呈汇合状态 ,换无血清 DMEM 同步 24 h 后进行实验。实验分 4组 :凝血酶 (410 ku ·L - 1 )组 ;凝血酶 (410 ku·L - 1 ) +水蛭素 (610 ku·L - 1 ) 组 ;凝血酶 (410 ku·L - 1 ) + 肝素(610 ku·L - 1 ) 组 ;以无血清的 DMEM 培养液为空白对照组。按温育时间再分为 6 ,12 ,24 和 48 h 亚组。每组实验重复 3 次。212 　多形核粒细胞分离[ 6] 　在健康成年男性志愿者 (抽血前 2 周未服过任何药物) 肘前静脉采血 40mL ,加入含 3109 %枸橼酸钠无菌瓶中。第一步用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法分离血细胞。第二步用 5 % Dextran T500 溶液按重力沉降法分离粒细胞。最后加入 012 % NaCl 溶液 5 mL 以裂解残存的红细胞 ,30s 后加入等体积的 116 %NaCl 溶液使渗透压恢复至等渗。在 1 000 r·min - 1 4 ℃离心 10 min ,弃上清。沉淀用 0101 mol·L - 1 磷酸盐缓冲溶液 ( PBS ,pH 7140)洗 2 次 ,用含 20 %胎牛血清的 DMEM 培养液悬浮。用台盼蓝法计数细胞计算存活率 ,活细胞比率 > 95 %。细胞涂片作瑞氏染色检测细胞纯度 >98 %。用培养液配成密度为 5 ×106 个·mL - 1 接种于 24 孔培养板。20 %胎牛血清的 DMEM 培养液置37 ℃,CO2 培养箱。分组同上。213 　流式细胞术检测中性粒细胞 CD11b 表达 　将各组细胞悬液分别置于不同的洁净试管中 ,2 000·r·min - 1离心 20 min。分离细胞 ,并用 PBS 液洗涤 3 次。将细胞浓度调整为 1 ×106 个·mL - 1 ,每份取 250 μL ×3 分装 3 个试管。首先加入 FITC2CD11b 10μL 于 4 ℃反应 30 min , 然后加 FITC2IgG110μL ,避光反应 30 min , PBS 洗涤 2 次。洗涤后用015 mL PBS 悬浮细胞 , 上机检测。以 PBS 替代CD11b 单抗作阴性对照。上机前以标准荧光微球调整仪器 ,使变异系数稳定在 2 %以内。利用设门( Gating)的方法将中性粒细胞从单核细胞及淋巴细胞分离出来。收集 1 ×104 个细胞 ,荧光强度以对数放大。用 Cell Quest Plot 软件分析平均荧光强度。以平均荧光强度代表细胞表达 CD11b 水平。214 　酶联免疫吸附测定 ( ELISA) HUVEC 表达ICAM21 　采用双抗夹心 ELISA 法。将标准品 100μL 及按不同分组的细胞悬液 100μL 加入 96 孔酶标反应板孔之中。混匀封板 ,37 ℃反应 20 min。洗板 5次。每孔加入 50μL anti ICAM21 和 Biotin HRP ,封板 ,37 ℃反应 15 min。洗板 5 次。每孔加入 50μL 底物A 和 50μL 底物 B ,室温避光。每孔加入 100μL终止液 ,轻轻混匀。30 min 内在 450 nm 处读吸收度值。ICAM21 的浓度与吸收度成正比。通过绘制标准曲线求出标本中 ICAM21 的浓度。3 　统计学处理测定结果以均数 ±标准差 ( x ±s ) 表示 ,应用—099—　Chinese Journal of New Drugs 2005 ,Vol . 14 No. 8 中国新药杂志 2005 年第 14 卷第 8 期　SAS软件系统分别进行 ,用方差分析 (单Π双因素) ,组间两两比较用 q 检验。结 　　果1 　HUVEC表达 ICAM21在正常体外培养的条件下 , HUVEC 有 ICAM21 的少量表达 ,并保持在一相对稳定的水平。在凝血酶的诱导下 , HUVEC 表达 ICAM21 明显增多 ( P <0105) 。随时间延长 ,逐步升高 ,高峰在 24 h。水蛭素能降低 ICAM21 的表达 ,但不能降至正常水平。肝素不及水蛭素 ,尤其是在 ICAM21 表达高峰期。结果见表 1。表 1 　ELISA检测凝血酶、水蛭素对 HUVEC表达 ICAM21 的影响组 　别 n 不同温育时间的 ICAM21 含量Πpg·mL - 16h 12h 24h 48h对 　照 6 01374 ±01231 01394 ±01034 01389 ±01141 01366 ±01114凝血酶 6 01923 ±01109a 11415 ±01171a 11633 ±01046a 11223 ±01183a凝血酶 +水蛭素 6 01699 ±01023b 01701 ±01058b 01620 ±01046b 01613 ±01 219b凝血酶 +肝素 6 01623 ±01129b 01987 ±01222b 01819 ±01174b 01833 ±01091b　　与对照组比较 ,a : P < 0105 ;与凝血酶组比较 ,b : P < 0105 (下同)2 　多形核粒细胞 CD11b 表达在正常体外培养的情况下 ,随着时间延长人中性粒细胞表面 CD11b 轻微增高。在凝血酶的作用下 ,与对照组相比 ,CD11b 的表达显著上调 ,6 h 平均荧光强度增加明显 ,提示其中性粒细胞被激活 ,黏附性增加。随时间延长逐渐升高。48 h 呈现下降趋势( P < 0105) 。同时水蛭素、肝素显示出良好的抑制作用 ,但两者无明显差别。结果见表 2。表 2 　凝血酶及水蛭素对人多形核粒细胞表达 CD11b 水平的影响组 　别 n 不同温育时间的平均荧光强度(MFI)6 h 12 h 24 h 48 h对 　照 6 6618 ±713 7112 ±610 8911 ±819 9111 ±614凝血酶 6 10113 ±819a 11618 ±714a 13815 ±715a 12113 ±514a凝血酶 +水蛭素 6 8811 ±514b 9112 ±511b 10112 ±915b 10011 ±718b凝血酶 +肝素 6 8112 ±618b 9118 ±913b 11913 ±817b 11113 ±414b讨 　　论　　本实验结果显示凝血酶既诱导 HUVEC 表达ICAM21 又促进体外培养的血液中性粒细胞表达CD11b。在凝血酶的作用下 ,与对照组相比 ,内皮细胞 HUVEC 表达 ICAM21 增多 ,随时间延长 ,逐步升高。这与 Kaplanski 的结果一致[6 ] 。同时中性粒细胞 CD11b 的表达显著上调 ,6 h 平均荧光强度增加明显 ,提示其中性粒细胞被激活 ,黏附性增加。随时间延长逐渐升高。在时间上 ,凝血酶诱导 HUVEC表达 ICAM21 与中性粒细胞表达 CD11b 基本同步 ,在一定的范围内均呈时间效应关系。说明凝血酶对于这两种细胞的作用一致性。近年来研究发现 ,内皮细胞受到刺激后 ,不仅形态学发生改变 ,影响血管内膜的完整性 ,而且还能合成多种黏附分子 ,导致微循环内形成白细胞栓和血小板栓 ,影响微循环血液流变学 ,加重组织细胞缺氧。另外 ,黏附分子过度上调 ,使白细胞得以与内皮细胞由滚动形成牢固黏附 ,并穿过内皮细胞间隙 ,向炎症部位浸润。如果这一生理过程失控 ,形成白细胞2内皮细胞黏附瀑布反应 ,导致白细胞大量聚集 ,释放炎症介质和组织溶解酶 ,就会对细胞造成新的损伤。从本实验结果分析 ,水蛭素可以通过抑制黏附分子表达来降低凝血酶诱导的白细胞2内皮细胞黏附瀑布反应 ,从而保护血管。水蛭素对内皮细胞表达 ICAM21 的抑制作用较肝素强 ,而水蛭素与肝素均显示出对多形核粒细胞表达 CD11b 的抑制作用 ,二者未呈现明显差异。说明水蛭素、肝素对过程的干预作用存在不同的途径。Peter 等[7 ] 认为肝素通过封闭 CD11bΠCD18 的结合位点来抑制白细胞的活化和 ICAM21 表达。Rahman 等[8 ] 则认为是启动了核转录因子 (NF2κB) 信号传导途径。更确切的途径有待于进一步探索。用 DNA 重组技术生产的水蛭素是作用最强的特异性凝血酶抑制剂 ,它与凝血酶以等摩尔比形成非共价键紧密结合的稳定复合物 ,从而使凝血酶失活。实验证实水蛭素可以高效地阻止凝血酶诱导中性粒细胞活化后对内皮细胞的损伤 ,这为动脉粥样硬化的防治开辟了新的途径 ,并为临床合理应用水蛭素等药物提供实验基础。[作者简介 ] 　王敏 (1959 - ) ,女 ,教授 ,医学博士 ,主要从事冠心病及再狭窄机制研究。联系电话 : ( 0531) 5903198 ,13789870636 ,E2mail :minwang859 @hotmail. com。[ 参 考 文 献 ][1 ] 　Minami T , Sugiyama A , Wu SQ , et al . Thrombin and phenotypicmodulation of the endothelium [J ] 1 Arterioscler Thromb Vasc Biol ,2004 ,24 (1)∶41 - 53.[2 ] 　王敏 , 崔连群 , 张承俊 ,等. 凝血酶诱导血管内皮细胞生长因子的表达及水蛭素的抑制作用[J ] . 中国新药杂志 ,2004 ,13 (3)∶226 - 230.[3 ] 　王敏 ,崔连群 ,张承俊 ,等. 水蛭素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响[J ] ,中国动脉硬化 ,2003 ,11 (7)∶609 - 612.[4 ] 　王敏 ,张维东 ,崔连群 , 等. 水蛭素抑制人脐静脉内皮细胞基—199—　Chinese Journal of New Drugs 2005 ,Vol . 14 No. 8 中国新药杂志 2005 年第 14 卷第 8 期　质金属蛋白酶 - 2 的生成及活化 [J ] . 细胞生物学杂志 , 2004 ,26(4)∶409 - 412.[5 ] 　王敏 ,崔连群 , 张承俊 ,等. 核因子在凝血酶诱导血管内皮产生细胞基质金属蛋白酶22 中的作用 [J ] . 中国动脉硬化杂志 ,2004 ,12 (3)∶325 - 329.[6 ] 　Kaplanski G, Marin V , Fabrigoule M , et al . Thrombin2activatedhuman endothelial cells support monocyte adhesion in vitro followingexpression of intercellular adhesion molecule21 ( ICAM21 ; CD54) andvascular cell adhesion molecule21 (VCAM21 ; CD106) [J ] . Blood ,1998 ,92 (4)∶1259 - 1267.[7 ] 　Peter K, Schwarz M , Conradt C , et al . Heparin inhibits ligand bindingto the leukocyte integrin Mac21 ( CD11bΠCD18) [ J ] . Circulation ,1999 ,100 (14)∶1533 - 1539.[8 ] 　Rahman A , Anwar K N , True A L , et al . Thrombin2induced p65homodimer binding to downstream NF2kB site of the promoter mediatesendothelial ICAM - 1 expression and neutrophil adhesion [ J ] . JImmunol ,1999 ,162 (5)∶5466 - 5476.(接受日期 :2005 - 04 - 15)3 基金项目 :广东省自然科学基金资助项目 (000453)纤维素硫酸酯体内抗凝血活性的实验研究 3王兆梅 ,李 　琳 ,蔡妙颜 ,桂 　林(华南理工大学食品与生物工程学院 ,广州 510640)　　[摘要 ] 　目的 :研究纤维素硫酸酯对动物体内的抗凝血活性。方法 : 用试管法测凝血时间 (CT) ,用凝固法测定活化部分凝血活酶时间 (APTT) 、凝血酶原时间 (PT)和凝血酶时间 (TT) ,以肝素和硫酸化右旋糖酐为阳性对照 ,考察其抗凝血活性的量效性和时效性。结果 : 纤维素硫酸酯能显著延长 CT ,APTT和 TT ,且呈剂量依赖性 ,但在所试剂量范围内对 PT 无明显影响 ;其抗凝血活性在给药 2 h 时达到最大。结论 : 纤维素硫酸酯具有明显抗凝血作用 ,强于现有同类抗凝血药硫酸化右旋糖酐 ,略低于 150 IU·mg - 1的肝素。　　[关键词 ] 　纤维素硫酸酯 ;抗凝血活性 ;大鼠[中图分类号 ] R96511 ;R97312 　　[文献标识码 ] A 　　[文章编号 ] 1003 - 3734(2005) 08 - 0992 - 03Anticoagulant activity of cellulose sulfate in vivoWANG Zhao2mei , LI Lin , CAI Miao2yan , GUI Lin( College of Food & Bioengineering , South China University of Technology , Guangzhou 510640 , China)[ Abstract ] 　Objective : To assess the anticoagulant activity of cellulose sulfate in vivo. Methods :Coagulation time (CT) was measured using a test tube method. Activated partial thromboplastin time (APTT) ,thrombin time ( TT) , and pro2thrombin time ( PT) were monitored via a coagulation method. Heparin anddextran sulfate were used as positive controls. Results : CT , APTT and TT were significantly prolonged bycellulose sulfate in a dose2dependent manner. No significant difference in PT was observed. The maximalanticoagulant potency achieved in 2 hours after the administration of cellulose sulfate. Conclusion : Cellulosesulfate presents an obvious anticoagulant activity. The anticoagulant potency of cellulose sulfate was morepowerful than dextran but less than heparin of 150 IUΠmg.[ Key words ] 　cellulose sulfate ; anticoagulant activity ; rats　　抗凝血剂是阻止血液凝固、维护血液动态平衡的有效物质。在临床上 ,抗凝血剂用于抗凝治疗DIC综合征、阻止手术后血管内凝血、治疗深度静脉栓塞以及预防心肺系统凝血的发生 ;抗凝血剂也是活血化淤药物的重要组成部分。在体外 ,抗凝血剂用于血液离体透析与体外保存 ;抗凝血剂还广泛用于生物相容性医用材料领域。纤维素硫酸酯是纤维素经硫酸酯化修饰得到的半合成硫酸酯多糖 ,研究表明 ,纤维素硫酸酯在体外具有突出的抗凝血作用[1 ,2 ] 。本实验在体外抗凝血研究的基础上 ,进一步研究纤维素硫酸酯在动物体内的抗凝血作用 ,为研制新型抗凝血制剂提供参考。材料与方法1 　材料SD 大鼠 ,180～200 g ,雌雄各半 ,由广州军区总—299—　Chinese Journal of New Drugs 2005 ,Vol . 14 No. 8 中国新药杂志 2005 年第 14 卷第 8 期　

Effects of hirudin for the thrombin-induced expression of adhesive molecules in neutrophils and human umbilical vein endothelial cells

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